DRG International EIA-5764 Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA Instruction Manual

EIA-5764 Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA

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Specifications

• Product: Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

• Manufacturer: DRG International, Inc.

• Calibrators: 10, 20, 75, 500, 2000 U/mL (units are arbitrary
  DRG units)

• Positive Controls: I & II

• Negative Control

• Reconstitution Buffer for ZnT8-Biotin

• Streptavidin Peroxidase (SA-POD)

• Diluent for SA-POD

• Peroxidase Substrate (TMB)

• Concentrated Wash Solution

• Stop Solution

Product Usage Instructions

Preparation

1. Ensure all required components are at room temperature before
   starting.

2. Dilute Streptavidin Peroxidase (SA-POD) by mixing with Diluent
   for SA-POD.

Assay Procedure

1. Label the microplate wells for samples, controls, and
   calibrators.

2. Add samples, controls, and calibrators to appropriate wells
   according to the provided instructions.

3. Incubate the plate for the specified time and temperature.

4. Wash the wells as instructed using the provided Wash
   Solution.

5. Add Substrate (TMB) to each well and incubate for the specified
   time.

6. Add Stop Solution to stop the reaction.

7. Read the absorbance at the specified wavelength.

Data Analysis

Use the provided typical results table as a reference. Calculate
sample concentrations based on the absorbance readings and
calibrator values.

FAQ

What is the assay cut off for this product?

The assay cut off is < 15 U/mL for Negative and ≥ 15 U/mL for
Positive results.

Should laboratories establish their own reference ranges?

Yes, each laboratory should establish its own normal and
pathological reference ranges for Zinc Transporter 8 Autoantibody
levels.

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Instructions for Use
Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA

EIA-5764 96

DRG Instruments GmbH, Germany Frauenbergstraße. 18, D-35039 Marburg
Phone: +49 (0)6421-1700 0, Fax: +49 (0)6421-1700 50 Website: www.drg- diagnostics.de E-mail: drg@drg-diagnostics.de

DRG International, Inc., USA 841 Mountain Ave., Springfield, NJ 07081
Phone: 973-564-7555, Fax: 973-564-7556 Website: www.drg- international.com E-mail: corp@drg-international.com

Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764
(12th September 2023, rev 20)
Please use only the valid version of the Instructions for Use provided with the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Gebrauchsanweisung. Si prega di usare la versione valida delle istruzioni per l’uso a disposizione con il kit. Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit. Utilisez seulement la version valide des Instructions d’utilisation fournies avec le kit.
Table of Contents
1 INTENDED USE………………………………………………………………………………………………………………………………………. 2 2 REFERENCES / LITERATURE………………………………………………………………………………………………………………….. 2 3 ASSAY PRINCIPLE …………………………………………………………………………………………………………………………………. 2 4 STORAGE AND PREPARATION OF TEST SERUM SAMPLES…………………………………………………………………….. 3 5 MATERIALS REQUIRED AND NOT SUPPLIED ………………………………………………………………………………………….. 3 6 PREPARATION OF REAGENTS SUPPLIED ………………………………………………………………………………………………. 3 7 ASSAY PROCEDURE ……………………………………………………………………………………………………………………………… 4 8 RESULT ANALYSIS…………………………………………………………………………………………………………………………………. 5 9 ASSAY CUT OFF…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 5 10 CLINICAL EVALUATION ………………………………………………………………………………………………………………………….. 6 11 SAFETY CONSIDERATIONS ……………………………………………………………………………………………………………………. 6 12 ASSAY PLAN ………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7
1 DESTINAZIONE D’USO……………………………………………………………………………………………………………………………. 8 2 BIBLIOGRAFIA / LETTERATURA………………………………………………………………………………………………………………. 8 3 PRINCIPIO DEL SAGGIO …………………………………………………………………………………………………………………………. 8 4 CONSERVAZIONE E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI SIERO DI TEST …………………………………………………… 9 5 MATERIALI NECESSARI E NON FORNITI …………………………………………………………………………………………………. 9 6 PREPARAZIONE DEI REAGENTI FORNITI………………………………………………………………………………………………… 9 7 PROCEDURA DI ANALISI ………………………………………………………………………………………………………………………. 10 8 ANALISI DEI RISULTATI ………………………………………………………………………………………………………………………… 11 9 CUT OFF DEL SAGGIO………………………………………………………………………………………………………………………….. 11 10 VALUTAZIONE CLINICA ………………………………………………………………………………………………………………………… 12 11 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA …………………………………………………………………………………………………… 12 12 PIANO DEL SAGGIO ……………………………………………………………………………………………………………………………… 14
SYMBOLS USED ………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764
1 INTENDED USE The Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA kit is intended for use by professional persons only, for the quantitative determination of Zinc Transporter 8 Autoantibody (ZnT8 Ab) in human serum. Autoantibodies to pancreatic beta cell antigens are important serological markers of type 1 diabetes mellitus (type 1 DM). The antigens recognised by these antibodies include insulin, glutamic acid decarboxylase (GAD65 kDa isoform), the islet cell antigen IA-2 or ICA-512 and zinc transporter 8 (ZnT8). ZnT8 Autoantibodies are directed principally to the C terminal domain of ZnT8 (residues 268 ­ 369). Human population gene polymorphism at the codon for the 325th amino acid results in the expression of three protein variants: Arginine (R) 325, Tryptophan (W) 325 and very rarely Glutamine (Q) 325. ZnT8 Ab may be specific to the R 325 or W 325 variant, or may be residue 325 non-specific. Sera that react with the Q allele only are extremely rare. ZnT8 Ab ELISA (EIA-5764) is capable of detecting, and quantifying, autoantibodies specific to R 325 or to W 325, or to residue 325 non-specific variants.
2 REFERENCES / LITERATURE 1. J. M. Wenzlau et al
“The cation efflux transporter ZnT8 (Slc30A8) is a major autoantigen in human type I diabetes.” PNAS 2007 104:17040-17045 2. P. Achenbach et al “Autoantibodies to zinc transporter 8 and SLC30A8 genotype stratify type 1 diabetes risk.” Diabetologia 2009 52:1881-1888 3. J. M. Wenzlau et al “Kinetics of the post-onset decline in zinc transporter 8 autoantibodies in type 1 diabetic human subjects.” J Clin Endocrinol Metab 2010 95:4712 – 4719 4. L. Petruzelkova et al “The dynamic changes of zinc transporter 8 autoantibodies in Czech children for the onset of type 1 diabetes mellitus.” Diabet Med 2014 31:165 – 71 5. G. Dunseath et al “Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus.” Clin. Chim. Acta. 2015 447:90 – 95
PATENTS The following patents apply: European patents EP 1 563 071 B1 and EP 2 118 309 B1, US patents US 7,851,164 B2 and US 9,023,984 B2, Chinese patents CN 1738900 B and ZL 200780051859.3, Indian patent 279741 and Japanese patents 4498144 and 5694668.
3 ASSAY PRINCIPLE In the Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA, ZnT8 Ab in test patients’ sera, calibrators and controls are allowed to interact with ZnT8 coated onto ELISA plate wells. After a 16 – 20 hour incubation, the samples are discarded leaving ZnT8 Ab bound to the ZnT8 coated wells. ZnT8-Biotin is added in a 2nd incubation step where, through the ability of ZnT8 Ab in the samples to act bivalently (or polyvalently), a bridge is formed between ZnT8 bound to the wells and ZnT8-Biotin. Unbound ZnT8-Biotin is then removed in a wash step and the amount of bound ZnT8-Biotin determined (in a 3rd incubation step) by addition of Streptavidin Peroxidase (SA-POD), which binds specifically to Biotin. Excess, unbound SA-POD is then washed away and addition of the peroxidase substrate 3,3′,5,5′-tetramethyl-benzidine (TMB) results in formation of a blue colour. This reaction is stopped by addition of stop solution causing the well contents to turn yellow. The absorbance of the yellow reaction mixture at 405 nm and 450 nm is then read using an ELISA plate reader. A higher absorbance indicates the presence of ZnT8 Ab in the test sample. Reading at 405 nm allows quantitation of high absorbances and should be used when the OD at 450 nm is greater than 3.0. If it is possible to read at only one wavelength 405 nm may be used. The measuring interval is 15 ­ 2000 U/mL (arbitrary DRG units).

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

4 STORAGE AND PREPARATION OF TEST SERUM SAMPLES Sera to be analysed should be assayed soon after separation or stored, preferably in aliquots, at or below -20 °C. 50 µL is sufficient for one assay (duplicate 25 µL determinations). Repeated freeze thawing or increases in storage temperature should be avoided. Do not use lipaemic or haemolysed serum samples. Citrate and heparin plasma may be used in the assay. Studies in which EDTA plasma samples were spiked with ZnT8 Ab positive sera showed that lower signals were observed compared with spiked serum from the same donor. In particular OD450 values with spiked EDTA plasma were 33% – 65% of spiked serum or 37% – 64% in terms of U/mL (19 samples with spiked serum concentrations ranging from 11 U/mL ­ 326 U/mL). When required, bring test sera to room temperature and mix gently to ensure homogeneity. Centrifuge sera prior to assay (preferably for 5 min at 10-15 000 rpm in a microfuge) to remove particulate matter. Please do not omit this centrifugation step if sera are cloudy or contain particulates.

5 MATERIALS REQUIRED AND NOT SUPPLIED – Pipettes capable of dispensing 25 µL and 100 µL. – Means of measuring out various volumes to reconstitute or dilute reagents. – Pure water. – ELISA Plate reader suitable for 96 well formats and capable of measuring at 450 nm and 405 nm. – ELISA Plate shaker, capable of 500 shakes/min (not an orbital shaker). – ELISA Plate cover.
6 PREPARATION OF REAGENTS SUPPLIED Store unopened kits and all components at 2 °C – 8 °C.

A B1-5 C1-2 D E F

ZnT8 Coated Wells 12 breakapart strips of 8 wells (96 in total) in a frame and sealed in a foil bag. Allow to stand at room temperature (20 °C -25 °C) for at least 30 minutes before opening. Ensure wells are firmly fitted into frame provided. After opening return any unused wells to the original foil bag with desiccant provided and seal with adhesive tape. Place foil bag in the self- seal plastic bag and store at 2 °C – 8 °C for up to 3 months.
Calibrators 10, 20, 75, 500, 2000 U/mL (units are arbitrary DRG units) 5 x 0.7 mL Ready for use
Positive Controls I & II
(see label for concentration range) 2 x 0.7 mL Ready for use
Negative Control 0.7 mL Ready for use
ZnT8-Biotin 3 vials Lyophilised Reconstitute each vial with 5.5 mL reconstitution buffer for ZnT8-Biotin (F). When more than one vial is used, pool the vials and mix gently before use. Store at 2 °C – 8 °C for up 3 days after reconstitution.
Reconstitution Buffer for ZnT8-Biotin 2 x 15 mL, coloured red Ready for use

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

Streptavidin Peroxidase (SA-POD)

0.7 mL

Concentrated

G

Dilute 1 in 20 with Diluent for SA-POD (H) before use.

For example, 0.5 mL (G) + 9.5 mL (H).

Store at 2 °C – 8 °C for up to 16 weeks after dilution.

Diluent for SA-POD

H

15 mL

Ready for use

Peroxidase Substrate (TMB)

I

15 mL

Ready for use

Concentrated Wash Solution

125 mL Concentrate

J

Dilute 10 X with pure water before use.

For example, 100 mL (J) + 900 mL pure water.

Store at 2 °C – 8 °C for up to kit expiry date.

Stop Solution

K

12 mL

Ready for use

7 ASSAY PROCEDURE Allow all reagents to reach room temperature (20 °C – 25 °C) on day of use, except ZnT8-Biotin and reconstitution buffer for ZnT8-Biotin. A repeating Eppendorf type pipette is recommended for steps 4, 7, 10 and 11.

Day 1

Day 2

Pipette 25 µL of calibrators (B1-5), controls (C1-2 and D) and patients’ sera into respective wells, in

duplicate is recommended, leaving two wells empty for blanks (see step 12).

2. Cover the frame, shake for approximately 5 seconds on a plate shaker and incubate overnight, for 16 – 20 hours, at 2 °C – 8 °C without shaking.

3. Use an ELISA plate washer to aspirate and wash the wells three times with diluted wash solution (J). If a plate washer is not available, discard the well contents by briskly inverting the frame of wells over a suitable receptacle, wash three times manually and finally tap the inverted wells gently on a clean dry absorbent surface.

4. Pipette 100 µL of the cold reconstituted ZnT8-Biotin (E) into each well (except blanks). Avoid splashing the material out of the wells during addition.

5. Cover the frame and incubate at 2 °C – 8 °C for 1 hour without shaking.

6. Repeat wash step 3.

7. Pipette 100 µL of diluted SA-POD (G) into each well (except blanks).

8. Cover the frame and incubate at room temperature (20 °C – 25 °C) for 20 minutes on an ELISA plate shaker (500 shakes per min).

9. Repeat wash step 3. If manual washing is being carried out use one additional wash step with pure water (to remove any foam) before finally tapping the inverted wells dry.

10. Pipette 100 µL of TMB (I) into each well (including blanks) and incubate in the dark at room temperature (20 °C – 25 °C) for 20 minutes without shaking.

11. Pipette 100 µL stop solution (K) to each well (including blanks) cover the frame and shake for approximately 5 seconds on a plate shaker. Ensure substrate incubations are the same for each well.

12. Within 30 minutes, read the absorbance of each well at 405 nm, then at 450 nm, using an ELISA plate reader, blanked against the wells containing 100 µL of TMB (I) and 100 µL stop solution (K) only.

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

8 RESULT ANALYSIS A calibration curve can be established by plotting calibrator concentration on the x-axis (log scale) against the absorbance of the calibrators on the y-axis (linear scale). The ZnT8 Ab concentrations in patients’ sera can then be read off the calibration curve [plotted at DRG as a spline log/lin curve (smoothing factor = 0)]. Other data reduction systems can be used. The negative control (D) has a concentration of 0 U/mL, but can be assigned a value of 1 U/mL to facilitate computer processing of data. Samples with high ZnT8 Ab concentrations can be diluted in kit negative control (D). For example, 15 µL of sample plus 135 µL of negative control to give a 10x dilution. Other dilutions (e.g. 100x) can be prepared from a 10x dilution or otherwise as appropriate. Some sera will not dilute in a linear way.

TYPICAL RESULTS (example only, not for calculation of actual results)

Calibrator

A450 nm

Conc. A405 Conc. U/mL nm U/mL

B1

0.068

10 0.023 10

B2

0.138

20 0.043 20

B3

0.610

75 0.184 75

B4

2.838 500 0.853 500

B5

8.089 2000 2.379 2000

Negative Control (D) Positive Control (CI) Positive Control (CII)

0.015 0.402 1.221

0

0.008 0

46 0.121 46

200 0.367 196

For absorbance readings at 450 nm above 3.0, the absorbance reading at 405 nm can be converted to 450 nm absorbance values by multiplying by the appropriate factor (3.4 in the case of equipment used at DRG).

9 ASSAY CUT OFF Cut off Negative Positive

U/mL < 15 U/mL 15 U/mL

This cut off has been validated at DRG. However each laboratory should establish its own normal and pathological reference ranges for ZnT8 Ab levels.
Also it is recommended that each laboratory include its own panel of control samples in the assay.

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

10 CLINICAL EVALUATION
10.1 Clinical Specificity and Sensitivity In the IASP 2016 study the ZnT8 Ab ELISA kit achieved 99% (n = 90) specificity and 72% (n = 50) sensitivity. Assay of 297 healthy blood donor sera gave a mean value of 1.9 ± 3.84 U/mL. 3 sera (1%) were above the assay cut off giving values of 45, 41 and 19 U/mL.

10.2 Lower Detection Limit The negative control was assayed 20 times and the mean and standard deviation calculated. The lower detection limit at +2 standard deviations was 1.2 U/mL when the negative control was assigned a value of 1 U/mL.

10.3 Inter Assay Precision

Sample

Mean U/mL (n=20)

A

102

B

64

C

26.6

CV (%) 9.3 7.5 8.7

10.4 Intra Assay Precision

Sample

Mean U/mL (n=25)

1

160

2

63

3

24.5

CV (%) 6.2 6.2 3.5

10.5 Clinical Accuracy Sera containing rheumatoid factor (n = 26) and sera containing autoantibodies to thyroglobulin (n = 20), to thyroid peroxidase (n = 24), to aquaporin-4 (n = 3) and to the acetylcholine receptor (n = 9) were negative for ZnT8 Ab. 4% (n = 24) of sera positive for antibodies to the TSH receptor, and 9% (n = 23) of sera positive for 21-hydroxylase Ab were positive for ZnT8 Ab using the ZnT8 Ab ELISA (EIA-5764) kit.

10.6 Interference No interference was observed when samples were spiked with the following materials; haemoglobin at 500 mg/dL, bilirubin at 20 mg/dL or Intralipid up to 3000 mg/dL.

11 SAFETY CONSIDERATIONS Streptavidin Peroxidase (SA-POD) Signal word: Warning Hazard statement(s) H317: May cause an allergic skin reaction Precautionary statement(s) P280: Wear protective gloves/protective clothing/ eye protection/face protection P302 + P352: IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water P333 + P313: If skin irritation or rash occurs: Get medical advice/attention P362 + P364: Take off contaminated clothing and wash it before reuse
Peroxidase Substrate (TMB) Signal word: Danger Hazard statement(s) H360: May damage fertility or the unborn child Precautionary statement(s) P280: Wear protective gloves/protective clothing/ eye protection/face protection P308 + P313: IF exposed or concerned: Get medical advice/attention

Diluent for SA-POD
Hazard statement(s) EUH208: Contains 2-Chloroacetamide. May produce an allergic reaction. This kit is intended for use by professional persons only. Follow the instructions carefully.

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

Observe expiry dates stated on the labels and the specified stability for reconstituted reagents. Refer to Safety Data Sheet for more detailed safety information. Avoid all actions likely to lead to ingestion. Avoid contact with skin and clothing. Wear protective clothing. Material of human origin used in the preparation of the kit has been tested and found non-reactive for HIV1 and 2 and HCV antibodies and HBsAg but should, none-the-less, be handled as potentially infectious. Wash hands thoroughly if contamination has occurred and before leaving the laboratory. Sterilise all potentially contaminated waste, including test specimens before disposal. Material of animal origin used in the preparation of the kit has been obtained from animals certified as healthy but these materials should be handled as potentially infectious. Some components contain small quantities of sodium azide as preservative. With all kit components, avoid ingestion, inhalation, injection or contact with skin, eyes or clothing. Avoid formation of heavy metal azides in the drainage system by flushing any kit component away with copious amounts of water.

12 ASSAY PLAN

Allow all reagents and samples to reach room temperature (20 °C – 25 °C) on day of use, except ZnT8- Biotin and reconstitution buffer for ZnT8-Biotin

Day 1

Pipette:

25 µL Calibrators, controls and patient sera into wells (except blanks) ) and shake for 5 seconds

Incubate:

Overnight (16 – 20 hours) at 2 °C – 8 °C without shaking

Aspirate/Decant:

Plate

Wash:

Plate three times and tap dry on absorbent material1

Pipette:

100 µL cold ZnT8-Biotin (reconstituted) into each well (except blanks)

Incubate:

1 hour at 2 °C – 8 °C without shaking

Aspirate/Decant:

Plate

Wash:

Plate three times and tap dry on absorbent material1

Pipette:

100 µL SA-POD (diluted 1:20) into each well (except blanks)

Day 2

Incubate:

20 minutes at room temperature (20 °C – 25 °C) on an ELISA plate shaker at 500 shakes/min

Aspirate/Decant:

Plate

Wash:

Plate three times, rinse with pure water and tap dry on absorbent material1

Pipette:

100 µL TMB into each well (including blanks)

Incubate:

20 minutes at room temperature (20 °C – 25 °C) in the dark

Pipette:

100 µL Stop Solution into each well (including blanks) and shake for 5 seconds

Read absorbance at 405 nm and then at 450 nm, within 30 minutes of adding stop solution

1 It is not necessary to tap dry the plates after washing when an automatic plate washer is used. Also the pure water wash step can be omitted when using an automatic washer.

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764
1 DESTINAZIONE D’USO Il kit Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA è destinato esclusivamente all’uso da parte di professionisti, per la determinazione quantitativa dell’autoanticorpo Zinc Transporter 8 (ZnT8 Ab) nel siero umano. Gli autoanticorpi contro gli antigeni delle cellule beta pancreatiche sono importanti marcatori sierologici del diabete mellito di tipo 1 (DM di tipo 1). Gli antigeni riconosciuti da questi anticorpi includono l’insulina, la decarbossilasi dell’acido glutammico (isoforma GAD65 kDa), l’antigene delle cellule insulari IA-2 o ICA-512 e il trasportatore di zinco 8 (ZnT8). Gli autoanticorpi ZnT8 sono diretti principalmente verso il dominio C terminale di ZnT8 (residui 268 ­ 369). Il polimorfismo genico della popolazione umana al codone per l’amminoacido 325° provoca l’espressione di tre varianti proteiche: Arginina (R) 325, Triptofano (W) 325 e molto raramente Glutammina (Q) 325. ZnT8 Ab può essere specifico per la variante R 325 o W 325 o può essere il residuo 325 non specifico. I sieri che reagiscono solo con l’allele Q sono estremamente rari. ZnT8 Ab ELISA (EIA-5764) è in grado di rilevare e quantificare gli autoanticorpi specifici per R 325 o W 325 o per varianti non specifiche del residuo 325.
2 BIBLIOGRAFIA / LETTERATURA 1. J. M. Wenzlau et al “The cation efflux transporter ZnT8 (Slc30A8) is a major autoantigen in human type I diabetes.” PNAS 2007 104:17040-17045 2. P. Achenbach et al “Autoantibodies to zinc transporter 8 and SLC30A8 genotype stratify type 1 diabetes risk.” Diabetologia 2009 52:1881-1888 3. J. M. Wenzlau et al “Kinetics of the post- onset decline in zinc transporter 8 autoantibodies in type 1 diabetic human subjects.” J Clin Endocrinol Metab 2010 95:4712 – 4719 4. L. Petruzelkova et al “The dynamic changes of zinc transporter 8 autoantibodies in Czech children for the onset of type 1 diabetes mellitus.” Diabet Med 2014 31:165 – 71 5. G. Dunseath et al “Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus.” Clin. Chim. Acta. 2015 447:90 – 95
BREVETTI Si applicano i seguenti brevetti: Brevetti europei EP 1 563 071 B1 e EP 2 118 309 B1, brevetti statunitensi US 7,851,164 B2 e US 9,023,984 B2, brevetti cinesi CN 1738900 B e ZL 200780051859.3, brevetti indiani 279741 e brevetti giapponesi 4498144 e 5694668.
3 PRINCIPIO DEL SAGGIO Nel kit Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA, ZnT8 Ab nei sieri dei pazienti da testare, i calibratori e i controlli possono interagire con ZnT8 rivestito su pozzetti per piastre ELISA. Dopo un’incubazione di 16 – 20 ore, i campioni vengono scartati lasciando ZnT8 Ab legato ai pozzetti rivestiti di ZnT8. ZnT8-Biotina viene aggiunta in una seconda fase di incubazione dove, attraverso la capacità di ZnT8 Ab nei campioni di agire bivalentemente (o polivalentemente), si forma un ponte tra ZnT8 legato ai pozzetti e ZnT8-Biotina. La ZnT8-biotina non legata viene quindi rimossa in una fase di lavaggio e la quantità di ZnT8-biotina legata viene determinata (in una terza fase di incubazione) mediante l’aggiunta di streptavidina perossidasi (SA-POD), che si lega specificamente alla biotina. L’eccesso di SA-POD non legato viene quindi lavato via e l’aggiunta del substrato della perossidasi 3,3′,5,5′-tetrametil-benzidina (TMB) provoca la formazione di un colore blu. Questa reazione viene interrotta dall’aggiunta di una soluzione di stop che fa ingiallire il contenuto del pozzetto. L’assorbanza della miscela di reazione gialla a 405 nm e 450 nm viene quindi letta utilizzando un lettore di piastre ELISA. Un’assorbanza più elevata indica la presenza di ZnT8 Ab nel campione di test. La lettura a 405 nm consente la quantificazione di assorbanze elevate e deve essere utilizzata quando il diametro esterno a 450 nm è maggiore di 3,0. Se è possibile leggere ad una sola lunghezza d’onda, si possono usare 405 nm. L’intervallo di misurazione è compreso tra 15 e 2000 U/mL (unità DRG arbitrarie).

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Zinc Transporter 8 Autoantibody ELISA EIA-5764

4 CONSERVAZIONE E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI SIERO DI TEST I sieri da analizzare devono essere dosati subito dopo la separazione o conservati, preferibilmente in aliquote, a una temperatura pari o inferiore a -20 °C. 50 L sono sufficienti per un test (determinazioni duplicate da 25 L). Evitare ripetuti congelamenti, scongelamenti o aumenti della temperatura di conservazione. Non utilizzare campioni di siero lipemizzante o emolizzato. Nel saggio possono essere utilizzati citrato ed eparina plasmatica. Gli studi in cui i campioni di plasma EDTA sono stati addizionati con sieri positivi per ZnT8 Ab hanno mostrato che sono stati osservati segnali più bassi rispetto al siero spike dello stesso donatore. In particolare, i valori di OD 450 con plasma EDTA spiked erano 33% – 65% del siero spiked o 37% – 64% in termini di U/mL (19 campioni con concentrazioni sieriche spiked comprese tra 11 U/mL e 326 U/mL). Se necessario, portare i sieri di test a temperatura ambiente e mescolare delicatamente per garantire l’omogeneità. Centrifugare i sieri prima del saggio (preferibilmente per 5 minuti a 10-15 000 giri/min in una microcentrifuga) per rimuovere il particolato. Si prega di non omettere questa fase di centrifugazione se i sieri sono torbidi o contengono particolato.

5 MATERIALI NECESSARI E NON FORNITI
– Pipette in grado di erogare 50 L e 100 L. – Mezzi di misurazione di vari volumi per ricostituire o diluire i reagenti forniti. – Acqua pura. – Lettore di piastre ELISA adatto per formati a 96 pozzetti e in grado di misurare a 450 nm e 405 nm. – Agitatore di piastre ELISA, capace di 500 scuotimenti/min (non un agitatore orbitale). – Coperchio piastra ELISA.

6 PREPARAZIONE DEI REAGENTI FORNITI Conservare i kit non aperti e tutti i componenti tra 2 °C e 8 °C.

A B1-5 C1-2 D E F

Pozzetti rivestiti ZnT8 12 strisce da spezzare con 8 pozzetti (96 in totale) in un quadro di supporto e sigillate in un sacchetto di alluminio. Lasciare che il sacchetto raggiunga la temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) per 30 minuti prima di aprirlo. Assicurarsi che i pozzetti siano fermamente fissati al supporto. Dopo aver aperto la confezione, rimettere i pozzetti inutilizzati nel sacchetto in alluminio con l’essicante fornito e sigillarlo con nastro adesivo. Collocare il sacchetto in alluminio in quello di plastica auto- sigillante e conservare a 2 °C – 8 °C per un massimo di 3 mesi.
Calibratori 10, 20, 75, 500, 2000 U/mL (le unità sono unità DRG arbitrarie) 5 x 0.7 mL
Pronto all’uso
Controlli Positivi I & II
(vedere etichette per range di concentrazione) 2 x 0.7 mL
Pronto all’uso
Controllo Negativo 0.7 mL
Pronto all’uso
ZnT8-Biotina 3 fiale Liofilizzato Ricostituire ciascuna fiala con 5.5 mL di tampone di ricostituzione per ZnT8-Biotina (F). Quando viene usata più di una fiala, raggruppare le fiale
e mescolare delicatamente prima dell’uso. Conservare a 2 °C – 8 °C fino a 3 giorni dopo la ricostituzione.
Tampone di Ricostituzione per ZnT8-Biotina 2 x 15 mL, di colore rosso
Pronto all’uso

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Streptavidina Perossidasi (SA-POD)

0.7 mL

G

Concentrato Diluire 1 a 20 con il diluente per SA-POD (H) prima dell’uso.

Per esempio, 0.5 mL (G) + 9.5 mL (H).

Conservare a 2 °C – 8 °C fino a 16 settimane dopo la diluizione.

Diluente for SA-POD

H

15 mL

Pronto all’uso

Substrato della Perossidasi (TMB)

I

15 mL

Pronto all’uso

Soluzione di lavaggio concentrata 125 mL Concentrato

J

Diluire 10 X con acqua pura prima dell’uso.

Per esempio, 100 mL (J) + 900 mL di acqua pura.

Conservare a 2 °C – 8 °C fino alla data di scadenza del kit.

Soluzione Stop

K

12 mL

Pronto all’uso

7 PROCEDURA DI ANALISI Lasciare che tutti i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) il giorno dell’uso, ad eccezione della ZnT8-Biotina e del tampone di ricostituzione per ZnT8-Biotina. Per i passaggi 4, 7, 10 e 11 si consiglia di utilizzare una pipetta di tipo Eppendorf a ripetizione.

Giorno 1

Pipettare 25 L di calibratori (B1-5), controlli (C1-2 e D) e sieri dei pazienti nei rispettivi pozzetti ­ si consiglia in duplice copia – lasciando due pozzetti vuoti per i blank (vedere il passaggio 12).

Coprire il telaio, agitare per circa 5 secondi su uno shaker e incubare per una notte, per 16 – 20 ore, a 2 °C – 8 °C senza agitare.

Utilizzare una lavapiastre ELISA per aspirare e lavare i pozzetti tre volte con soluzione di lavaggio diluita

(J). Se non è disponibile una lavapiastre, scartare il contenuto del pozzetto capovolgendo rapidamente il telaio dei pozzetti su un recipiente adatto, lavare tre volte manualmente e infine picchiettare

delicatamente i pozzetti rovesciati su una superficie assorbente pulita e asciutta.

Pipettare 100 L di ZnT8-Biotina (E) ricostituita a freddo in ciascun pozzetto (tranne nei blank). Evitare di spruzzare il materiale fuori dai pozzetti durante l’aggiunta.

Coprire il telaino e incubare a 2 °C – 8 °C per 1 ora senza agitare.

Ripetere il passaggio di lavaggio 3.

Pipettare 100 L di SA-POD (G) diluito in ciascun pozzetto (tranne nei blank).

Coprire il telaio e incubare a temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) per 20 minuti su un agitatore per piastre ELISA (500 agitazioni al min).

Ripetere il passaggio di lavaggio 3. Se si esegue il lavaggio manuale, utilizzare un’ulteriore fase di

lavaggio con acqua pura (per rimuovere l’eventuale schiuma) prima di asciugare definitivamente i pozzetti

invertiti.

Pipettare 100 L di TMB (I) in ciascun pozzetto (compresi i blank) e incubare al buio a temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) per 20 minuti senza agitare.

Pipettare 100 L di soluzione di stop (K) a ciascun pozzetto (compresi i blank), coprire il telaio e agitare 11. per circa 5 secondi su un agitatore per piastre. Assicurarsi che le incubazioni del substrato siano le stesse
per ogni pozzetto.
Entro 30 minuti, leggere l’assorbanza di ciascun pozzetto a 405 nm, quindi a 450 nm, utilizzando un 12. lettore per piastre ELISA, usando come blank di confronto i pozzetti contenenti solo 100 L di TMB (I) e
100 L di soluzione di stop (K).

Giorno 2

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8 ANALISI DEI RISULTATI È possibile stabilire una curva di calibrazione tracciando la concentrazione del calibratore sull’asse x (scala logaritmica) rispetto all’assorbanza dei calibratori sull’asse y (scala lineare). Le concentrazioni di ZnT8 Ab nel siero dei pazienti possono quindi essere lette dalla curva di calibrazione [tracciata in DRG come curva log/lin spline (fattore di smoothing = 0)]. Possono essere utilizzati altri sistemi di riduzione dei dati. Il controllo negativo (D) ha una concentrazione di 0 U/mL, ma gli può essere assegnato un valore di 1 U/mL per facilitare l’elaborazione informatica dei dati.
I campioni con alte concentrazioni di ZnT8 Ab possono essere diluiti in kit di controllo negativo (D). Ad esempio, 15 L di campione più 135 L di controllo negativo per ottenere una diluizione 10x. Altre diluizioni (ad esempio 100x) possono essere preparate da una diluizione 10x o in altro modo, a seconda dei casi. Alcuni sieri non si diluiscono in modo lineare.

RISULTATI TIPICI (solo come esempio; non utilizzare per il calcolo dei risultati reali)

Calibratore

A450 nm

Conc. A405 Conc. U/mL nm U/mL

B1

0.068 10

0.023 10

B2

0.138 20

0.043 20

B3

0.610 75

0.184 75

B4

2.838 500 0.853 500

B5

8.089 2000 2.379 2000

Controllo negativo (D)

0.015 0

0.008 0

Controllo positivo (CI)

0.402 46

0.121 46

Controllo positivo (CII)

1.221 200 0.367 196

Per le letture dell’assorbanza a 450 nm superiori a 3,0, la lettura dell’assorbanza a 405 nm può essere convertita in valori di assorbanza di 450 nm moltiplicando per il fattore appropriato (3,4 nel caso di apparecchiature utilizzate in DRG).

9 CUT OFF DEL SAGGIO
Cut off Negativo Positivo

U/mL < 15 U/mL 15 U/mL

Questo cut-off è stato convalidato da DRG. Tuttavia, ogni laboratorio deve stabilire i propri intervalli di riferimento normali e patologici per i livelli di ZnT8 Ab.
Inoltre, si raccomanda che ogni laboratorio includa nel test il proprio panel di campioni di controllo.

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10 VALUTAZIONE CLINICA

10.1 Specificità clinica e sensibilità Nello studio IASP 2016 il kit ZnT8 Ab ELISA ha raggiunto una specificità del 99% (n = 90) e una sensibilità del 72% (n = 50). L’analisi di 297 sieri sani di donatori di sangue ha dato un valore medio di 1,9 ± 3,84 U/mL. 3 sieri (1%) erano al di sopra del cut-off del test dando valori di 45, 41 e 19 U/mL.

10.2 Limite di rilevamento inferiore Il controllo negativo è stato analizzato 20 volte e sono state calcolate la media e la deviazione standard. Il limite di rilevamento inferiore a +2 deviazioni standard era di 1,2 U/mL quando al controllo negativo è stato assegnato un valore di 1 U/mL.

10.3 Precisione Inter Saggio

Campione

Media U/mL

CV

(n=20)

(%)

A

102

9.3

B

64

7.5

C

26.6

8.7

10.4 Precisione Intra Saggio

Campione

Media U/mL

CV

(n=25)

(%)

1

160

6.2

2

63

6.2

3

24.5

3.5

10.5 Accuratezza clinica I sieri contenenti fattore reumatoide (n = 26) e i sieri contenenti autoanticorpi contro la tireoglobulina (n = 20), la perossidasi tiroidea (n = 24), l’acquaporina-4 (n = 3) e il recettore dell’acetilcolina (n = 9) sono risultati negativi per ZnT8 Ab. Il 4% (n = 24) dei sieri positivi agli anticorpi contro il recettore del TSH e il 9% (n = 23) dei sieri positivi per la 21-idrossilasi Ab sono risultati positivi per ZnT8 Ab utilizzando il kitZnT8 Ab ELISA (EIA-5764).

10.6 Interferenza Non è stata osservata alcuna interferenza quando i campioni sono stati addizionati con i seguenti materiali; emoglobina a 500 mg/dL, bilirubina a 20 mg/dL o Intralipid fino a 3000 mg/dL.

11 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA
Streptavidina Perossidasi (SA-POD)
Avvertenza: Attenzione Indicazione/i di pericolo H317: Può provocare una reazione allergica cutanea Consiglio/i di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso P302 + P352: IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: lavare abbondantemente con acqua e sapone P333 + P313: In caso di irritazione cutanea o eruzione cutanea: consultare un medico P362 + P364: Togliersi di dosso gli indumenti contaminati e lavarli prima di riutilizzarli

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Substrato della perossidasi (TMB)
Avvertenza: Pericolo Indicazione/i di pericolo H360: Può nuocere alla fertilità o al feto Consiglio/i di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso P308 + P313: IN CASO di esposizione o preoccupazione: consultare un medico.
Diluente per SA-POD Indicazione/i di pericolo EUH208: Contiene 2-cloroacetammide. Può provocare una reazione allergica. Questo kit è destinato esclusivamente all’uso da parte di professionisti. Seguire attentamente le istruzioni. Rispettare le date di scadenza riportate sulle etichette e la stabilità specificata per i reagenti ricostituiti. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per informazioni più dettagliate sulla sicurezza. Evitare tutte le azioni che possono portare all’ingestione. Evitare il contatto con la pelle e gli indumenti. Indossare indumenti protettivi. Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del kit è stato testato ed è risultato non reattivo per gli anticorpi HIV1 e 2 e per l’HCV e l’HBsAg, ma dovrebbe comunque essere trattato come potenzialmente infettivo. Lavarsi accuratamente le mani in caso di contaminazione e prima di lasciare il laboratorio. Sterilizzare tutti i rifiuti potenzialmente contaminati, compresi i campioni di test prima dello smaltimento. Il materiale di origine animale utilizzato nella preparazione del kit è stato ottenuto da animali certificati come sani, ma questi materiali devono essere trattati come potenzialmente infettivi. Alcuni componenti contengono piccole quantità di azoturo di sodio come conservante. Con tutti i componenti del kit, evitare l’ingestione, l’inalazione, l’iniezione o il contatto con la pelle, gli occhi o gli indumenti. Evitare la formazione di azidi di metalli pesanti nel sistema di drenaggio lavando via qualsiasi componente del kit con abbondanti quantità d’acqua.

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12 PIANO DEL SAGGIO

Lasciare che tutti i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) il giorno che vengono usati, tranne la ZnT8- Biotina e il tampone di ricostituzione per la ZnT8-Biotina

Giorno 1

Pipettare:

25 L di calibratori, controlli e sieri dei pazienti nei pozzetti (tranne nei blank) e agitare per 5 secondi

Incubare: Aspirare/Decant: Lavare: Pipettare: Incubare:

Durante la notte (16 ­ 20 ore) a 2 °C ­ 8 °C senza agitare Piastra La piastra tre volte e asciugarla picchiettandola su un materiale assorbente1 100 µL di ZnT8-Biotina fredda (ricostituita) in ciascun pozzetto (tranne nei blank) 1 ora a 2 °C – 8 °C senza agitazione

Aspirare/Decant: Lavare: Pipettare:

La piastra La piastra tre volte e asciugarla picchiettandola su un materiale assorbente1 100 µL di SA-POD (diluito 1:20) in ciascun pozzetto (tranne nei blank)

Incubare:

20 minuti a temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) su un agitatore di piastre ELISA a 500 agitazioni /min

Aspirare/Decant: Lavare: Pipettare: Incubare:

La piastra La piastra tre volte e asciugarla picchiettandola su un materiale assorbente1 100 µL di TMB in ciascun pozzetto (compresi i blank) 20 minuti a temperatura ambiente (20 °C – 25 °C) al buio

Giorno 2

Pipettare:

100 µL di soluzione stop in ciascun pozzetto (compresi i blank) e agitare per 5 secondi

Leggere l’assorbanza a 450 nm e a 405 nm, entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione stop
1 Non è necessario asciugare le piastre picchiettandole dopo il lavaggio quando si utilizza una lavapiastre automatica. Anche la fase di lavaggio con acqua pura può essere omessa quando si utilizza una lavapiastre automatica.

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Diagnostica in vitro
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Référence

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Conformidade Europeia Consultar as instruções de uso Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Número de catálogo

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Número de lote

Contenuto sufficiente per “n” saggi
Temperatura di conservazione

Contenido suficiente para ensayos Temperatura de conservacion

Data di scadenza Fecha de caducidad

Fabbricante

Fabricante

No. de lot
Contenu suffisant pour “n” tests
Temperature de conservation Date limite d’utilisation Fabricant

Código do lote Suficiente para determinações Limites de temperatura Prazo de validade Fabricante

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Vertriebspartner *

Date of manufacture Herstellungsdatum

Biological risks *

Biologische Risiken *

Distributore Data di produzione Rischi biologici

Distribuidor Fecha de fabricación Riesgos biológicos

Distributeur

Distribuidor

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Risques biologiques Riscos biológicos

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Volume/Quantité

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References

• Analyticon® Biotechnologies GmbH
• It's Uptime | International® Trucks

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