DRG Diagnostics SLV-6145 Salivary Estradiol HS Elisa Instruction Manual
- September 27, 2024
- DRG Diagnostics
Table of Contents
SLV-6145 Salivary Estradiol HS Elisa
“`html
Product Information
Specifications
- Product Name: Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
- Manufacturer: DRG International, Inc.
- Intended Use: Quantitative measurement of active free estradiol
in saliva
Product Usage Instructions
Warnings and Precautions
-
This kit is for in vitro diagnostic use only and for
professional use only. -
Ensure all reagents containing human serum or plasma have been
tested and confirmed negative.
Reagents
-
Reagents Provided:
-
Microtiterwells, 12 x 8 strips, 96 wells coated with
anti-estradiol antibody (polyclonal) -
Standard (Standard 0 – 5), 6 vials, 1 mL each, ready to
use
-
-
Materials Required but Not Provided:
-
Calibrated microtiter plate reader (450 nm with reference
wavelength at 620 nm to 630 nm) -
Calibrated variable precision micropipettes
-
Absorbent paper, distilled water, timer
-
Graph paper or software for data reduction
-
Specimen Collection
Saliva samples should be collected using SALI-TUBES 100 (REF
SLV-4158, available from DRG). Other saliva sampling devices should
be validated under user responsibility. Samples must be thawed,
centrifuged, and clear supernatant transferred for testing.
FAQ
Q: How should I dispose of the kit and used
materials/reagents?
A: The disposal must be performed according to national
regulations. Refer to the Safety Data Sheet for specific disposal
information.
Q: What should I do if the test kit or components are
damaged?
A: Inform DRG in writing within one week of receiving the
damaged kit. Do not use damaged components for testing; store them
until a solution is found and dispose of them according to
regulations.
“`
Instructions for Use
Salivary Estradiol HS ELISA
SLV-6145 96
DRG Instruments GmbH, Germany Frauenbergstraße 18, 35039 Marburg Phone: +49 (0)6421-1700 0, Fax: +49 (0)6421-1700 50 Website: www.drg-diagnostics.de E-mail: drg@drg-diagnostics.de
DRG International, Inc., USA 841 Mountain Ave., Springfield, NJ 07081 Phone: 973-564-7555, Fax: 973-564-7556 Website: www.drg- international.com E-mail: corp@drg-international.com
Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
Please use only the valid version of the Instructions for Use provided with
the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene,
Gebrauchsanweisung. Si prega di usare la versione valida delle istruzioni per
l’uso a disposizione con il kit. Por favor, use sólo la versión válida de las
instrucciones de uso que se suministran con el kit. Utilisez seulement la
version valide des Instructions d’utilisation fournies avec le kit.
Table of Contents / Inhaltsverzeichnis / Tabella die Contenuti / Tabla de
Contenidos / Table des matières
1 INTENDED USE …………………………………………………………2 2 PRINCIPLE OF THE TEST…………………………………………..2 3 WARNINGS AND PRECAUTIONS ………………………………..3 4 REAGENTS ……………………………………………………………….4 5 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION…………….5 6 ASSAY PROCEDURE …………………………………………………5 7 EXPECTED NORMAL VALUES …………………………………..7 8 QUALITY CONTROL …………………………………………………..7 9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS………………………….7 10 LIMITATIONS OF USE ………………………………………………..9 11 LEGAL ASPECTS……………………………………………………….9
1 FINALIDAD PREVISTA………………………………………………22 2 FUNDAMENTO DEL ENSAYO ……………………………………22 3 PRECAUCIONES ……………………………………………………..22 4 COMPONENTES DEL KIT………………………………………….23 5 MUESTRAS ……………………………………………………………..24 6 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO …………………………………24 7 VALORES ESPERADOS ……………………………………………26 8 CONTROL DE CALIDAD ……………………………………………26 9 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO …………………………….26 10 LIMITACIONES DE USO ……………………………………………27 11 ASPECTOS LEGALES ………………………………………………27
1 ZWECKBESTIMMUNG………………………………………………10 2 TESTPRINZIP ………………………………………………………….10 3 VORSICHTSMAßNAHMEN ………………………………………..10 4 BESTANDTEILE DES KITS………………………………………..11 5 PROBENVORBEREITUNG ………………………………………..12 6 TESTDURCHFÜHRUNG ……………………………………………12 7 ERWARTETE WERTE ………………………………………………14 8 QUALITÄTSKONTROLLE ………………………………………….14 9 ASSAY-CHARAKTERISTIKA ……………………………………..14 10 GRENZEN DES TESTS …………………………………………….15 11 RECHTLICHE GRUNDLAGEN ……………………………………15
1 UTILISATION PRÉVUE ……………………………………………..28 2 PRINCIPE DU TEST ………………………………………………….28 3 AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS ……………………..28 4 RÉACTIFS ……………………………………………………………….29 5 PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES SPÉCIMENS ..30 6 RÉALISATION DU TEST ……………………………………………30 7 VALEURS NORMALES ATTENDUES ………………………….32 8 CONTROLE DE QUALITE ………………………………………….32 9 CARACTERISTIQUES DES PERFORMANCES ……………32 10 LIMITES D’UTILISATION……………………………………………33 11 ASPECTS JURIDIQUES…………………………………………….33
1 DESTINAZIONE D’USO …………………………………………….16 2 PRINCIPIO DEL TEST ………………………………………………16 3 PRECAUZIONI …………………………………………………………16 4 COMPONENTI DEL KIT …………………………………………….17 5 CAMPIONI ……………………………………………………………….18 6 ATTUAZIONE DEL TEST …………………………………………..18 7 VALORI NORMALI ……………………………………………………20 8 CONTROLLO QUALITÀ …………………………………………….20 9 CARATTERISTICHE DEL TEST………………………………….20 10 LIMITAZIONE DEL TEST …………………………………………..21 11 ASPETTI LEGALI ……………………………………………………..21
12 REFERENCES / LITERATURE …………………………………..34 SYMBOLS USED ……………………………………………………………..35
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
1 INTENDED USE The DRG Salivary Estradiol HS ELISA is an enzyme immunoassay
for the quantitative in vitro diagnostic measurement of active free estradiol
in saliva. Results may be used to assess fertility problems in women; to
diagnose menopause, and to monitor hormone replacement therapy.
1.1 Summary and Explanation Estradiol (1,3,5(10)-estratriene-3,17-diol;
17-estradiol; E21) is a C18 steroid hormone with a molecular weight of 272.4
Dalton. It is the most potent natural estrogen, produced mainly by granulosa
cells of the female ovary and the placenta by the aromatization of
androstenedione to estrone, followed by conversion of estrone to estradiol by
17-HSD. Estradiol is also synthesized in other tissues including testicles,
adrenal gland, fat tissue, liver, breast, and brain (1 5). In plasma,
estradiol is largely bound to SHBG and albumin. Only a fraction of 2.21 % is
free and biologically active, the percentage remaining constant throughout the
menstrual cycle (6-8). Estradiol acts primarily as an agonist of the estrogen
receptor (ER) subtypes ER and ER, nuclear steroid hormone receptors which
trigger the appropriate response at the nuclear level in the target sites.
These sites include follicles, uterus, breast, vagina, urethra, hypothalamus,
pituitary and to a lesser extent liver and skin. In the female, estradiol acts
as a growth hormone for tissue of the reproductive organs. During the
menstrual cycle, estradiol secretion follows a cyclic, biphasic pattern with
the highest concentration found immediately prior to ovulation. This estradiol
peak stimulates the hypothalamic-pituitary axis to secrete the gonadotropins
follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), which are
essential for follicular maturation and ovulation. In the luteal phase,
estradiol, in conjunction with progesterone, prepares the endometrium for
implantation (9-15). During pregnancy, estradiol concentration increases due
to placental production and high levels are sustained throughout pregnancy
(16.) Salivary steroid levels can reflect the circulating level of free
steroid rather than total levels in serum, which is explained by the absence
of circulating estradiol binding proteins. Therefore, saliva provides an
excellent specimen for monitoring estradiol levels across the menstrual cycle
or during hormone replacement therapy (17-19).
2 PRINCIPLE OF THE TEST The DRG Salivary Estradiol HS ELISA is a solid phase
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on the principle of
competitive binding. The microtiter wells are coated with a polyclonal
(rabbit) antibody directed towards antigenic sites of the estradiol molecule.
During incubation, the estradiol in the added sample competes with the added
enzyme conjugate, which is estradiol conjugated to horseradish peroxidase, for
binding to the coated antibody. After a washing step to remove all unbound
substances, the solid phase is incubated with the substrate solution. The
colorimetric reaction is stopped by addition of stop solution, and optical
density (OD) of the resulting yellow product is measured. The intensity of
colour is inversely proportional to the concentration of the analyte in the
sample. A standard curve is constructed by plotting OD values against
concentrations of standards, and concentrations of unknown samples are
determined using this standard curve.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
3 WARNINGS AND PRECAUTIONS
1. This kit is for in vitro diagnostic use only. For professional use only.
2. All reagents of this test kit which contain human serum or plasma have been
tested and confirmed negative for
HIV I/II, HBsAg and HCV by FDA approved procedures. All reagents, however,
should be treated as potential biohazards in use and for disposal. 3. Before
starting the assay, read the instructions completely and carefully. Use the
valid version of instructions for use provided with the kit. Be sure that
everything is understood. 4. The microplate contains snap-off strips. Unused
wells must be stored at 2 °C to 8 °C in the sealed foil pouch and used in the
frame provided. 5. Pipetting of samples and reagents must be done as quickly
as possible and in the same sequence for each step. 6. Use reservoirs only for
single reagents. This especially applies to the substrate reservoirs. Using a
reservoir for dispensing a substrate solution that had previously been used
for the conjugate solution may turn solution coloured. Do not pour reagents
back into vials as reagent contamination may occur. 7. Mix the contents of the
microplate wells thoroughly to ensure good test results. Do not reuse
microwells. 8. Do not let wells dry during assay; add reagents immediately
after completing the rinsing steps. 9. Allow the reagents to reach room
temperature (20 °C to 26 °C) before starting the test. Temperature will affect
the optical density readings of the assay. However, values for the patient
samples will not be affected. 10. Never pipet by mouth and avoid contact of
reagents and specimens with skin and mucous membranes. 11. Do not smoke, eat,
drink or apply cosmetics in areas where specimens or kit reagents are handled.
12. Wear disposable latex gloves when handling specimens and reagents.
Microbial contamination of reagents or specimens may give false results. 13.
Handling should be done in accordance with the procedures defined by an
appropriate national biohazard safety guideline or regulation. 14. Do not use
reagents beyond expiry date as shown on the kit labels. 15. All indicated
volumes have to be performed according to the protocol. Optimal test results
are only obtained when using calibrated pipettes and microtiter plate readers.
16. Do not mix or use components from kits with different lot numbers. It is
advised not to exchange wells of different plates even of the same lot. The
kits may have been shipped or stored under different conditions and the
binding characteristics of the plates may result slightly different. 17. Avoid
contact with Stop Solution containing 0.5 M H2SO4. It may cause skin
irritation and burns. 18. Some reagents contain Proclin 300, BND and/or MIT as
preservatives. In case of contact with eyes or skin, flush immediately with
water. 19. TMB substrate has an irritant effect on skin and mucosa. In case of
possible contact, wash eyes with an abundant volume of water and skin with
soap and abundant water. Wash contaminated objects before reusing them. If
inhaled, take the person to open air. 20. Chemicals and prepared or used
reagents have to be treated as hazardous waste according to the national
biohazard safety guideline or regulation. 21. For information on hazardous
substances included in the kit please refer to Safety Data Sheets. Safety Data
Sheets for this product are available upon request directly from DRG.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
4 REAGENTS 4.1 Reagents provided 1. Microtiterwells, 12 x 8 (break apart)
strips, 96 wells;
Wells coated with anti-estradiol antibody (polyclonal). 2. Standard (Standard
0 – 5), 6 vials, 1 mL each, ready to use;
Concentrations: 0 1 5 10 50 100 pg/mL The standards are calibrated
against the following reference material: Cerilliant E-060 Contain non-mercury
preservative. 3. Control Low & High, 2 vials, 1 mL each, ready to use; For
control values and ranges please refer to vial label or Certificate of
Analysis. Contain non-mercury preservative. 4. Enzyme Conjugate, 1 vial,14 mL,
ready to use; estradiol conjugated with horseradish peroxidase; Contains non-
mercury preservative. 5. Substrate Solution, 1 vial, 14 mL, ready to use;
Tetramethylbenzidine (TMB). 6. Stop Solution, 1 vial, 14 mL, ready to use;
Contains 0.5 M H2SO4, Avoid contact with the stop solution. It may cause skin
irritations and burns. 7. Wash Solution, 1 vial, 30 mL (40X concentrated); See
“Reagent Preparation”.
4.2 Materials required but not provided – A calibrated microtiter plate reader
(450 nm, with reference wavelength at 620 nm to 630 nm) (e.g. the DRG
Instruments Microtiter Plate Reader) – Calibrated variable precision
micropipettes – Absorbent paper – Distilled water – Timer – Graph paper or
software for data reduction
4.3 Storage Conditions When stored at 2 °C to 8 °C unopened reagents will
retain reactivity until expiration date. Do not use reagents beyond this date.
Opened reagents must be stored at 2 °C to 8 °C. Microtiter wells must be
stored at 2 °C to 8 °C. Once the foil bag has been opened, care should be
taken to close it tightly again. Opened kits retain activity for 8 weeks if
stored as described above.
4.4 Reagent Preparation Bring all reagents and required number of strips to
room temperature (20 °C to 26 °C) prior to use.
Wash Solution Add distilled water to the 40X concentrated Wash Solution.
Dilute 30 mL of concentrated Wash Solution with 1170 mL distilled water to a
final volume of 1200 mL. The diluted Wash Solution is stable for 1 week at
room temperature.
4.5 Disposal of the Kit The disposal of the kit and all used
materials/reagents must be performed according to the national regulations.
Special information for this product is given in the Safety Data Sheet,
section 13.
4.6 Damaged Test Kits In case of any damage to the test kit or components, DRG
must be informed in writing, at the latest one week after receiving the kit.
Damaged single components should not be used for a test run. They have to be
stored until a final solution has been found. After this, they should be
disposed of according to the official regulations.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
5 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Saliva can be used in this assay. The
sampling must be done in the morning before food intake, drinking or smoking.
It is recommended to rinse mouth thoroughly with cold water 5 minutes prior to
sampling. If sampling must be done during the day, eating, drinking, smoking,
chewing gums or brushing teeth should be avoided at least 2 hours before
sampling. Do not collect samples when oral diseases, inflammation or lesions
exist (blood contamination). Note: Samples containing sodium azide should not
be used in the assay.
Please refer to chapters “Interfering Substances” and “Drug Interferences”.
5.1 Specimen Collection Saliva samples should be collected using SALI-TUBES
100 ( REF SLV-4158, available from DRG). Other saliva sampling devices have
not been tested and should be validated under the responsibility of the user.
5.2 Specimen Storage and Preparation Fresh saliva samples Immediately after
arrival in the lab fresh saliva samples should be frozen at least overnight at
-20 °C. Each saliva sample has to be frozen, thawed, and centrifuged in order
to separate the mucins by centrifugation. Storage: immediately at -20 °C
Then samples must be thawed and centrifuged for 5 to 10 minutes at 10 000 g.
Thereafter, the clear supernatant must be transferred into a fresh tube. Only
this clear supernatant can be used as sample for the ELISA.
If a set of multiple samples has to be tested, the lab has to mix aliquots of
the supernatant of the 5 single samples in a separate sampling device and
perform the testing from this mixture.
Supernatant Storage: up to 7 days at 2 °C to 8 °C
at least 2 months at -20 °C, in aliquots
The supernatant should be frozen only once. Thawed supernatant should be
inverted several times prior to testing!
5.3 Specimen Dilution If in an initial assay, a specimen is found to contain
more analyte than the highest standard, the specimen can be diluted with 0.9%
NaCl and re-assayed as described in “Assay Procedure”. For the calculation of
the concentrations this dilution factor has to be taken into account.
Example: a) dilution 1:2: b) dilution 1:10:
50 µL sample + 50 µL 0.9% NaCl (mix thoroughly) 10 µL sample + 90 µL 0.9% NaCl (mix thoroughly)
6 ASSAY PROCEDURE
6.1 General Remarks
– All reagents and specimens must be allowed to come to room temperature
before use. All reagents must be mixed without foaming.
– Once the test has been started, all steps should be completed without
interruption. – Use new disposal plastic pipette tips for each standard,
control or sample in order to avoid cross contamination. – Optical density is
a function of the incubation time and temperature. Before starting the assay,
it is recommended that
all reagents are ready, caps removed, all needed wells secured in holder, etc.
This will ensure equal elapsed time for each pipetting step without
interruption. – As a general rule the enzymatic reaction is linearly
proportional to time and temperature.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
6.2 Test Procedure Each run must include a standard curve.
1. Secure the desired number of Microtiter wells in the frame holder. 2.
Dispense 100 µL of each Standard, Control and sample with new disposable tips
into appropriate wells. 3. Incubate for 60 minutes at room temperature. 4.
Dispense 100 µL Enzyme Conjugate into each well.
Thoroughly mix for 10 seconds. It is important to have a complete mixing in
this step. 5. Incubate for 60 minutes at room temperature. 6. Rinse the wells
3 times with 400 µL diluted Wash Solution per well, if a plate washer is used.
– OR Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the wells 3 times with
300 µL diluted Wash Solution per well for manual washing. Strike the wells
sharply on absorbent paper to remove residual droplets. Important note: The
sensitivity and precision of this assay is markedly influenced by the correct
performance of the washing procedure! 7. Add 100 µL of Substrate Solution to
each well. 8. Incubate for 30 minutes at room temperature. 9. Stop the
enzymatic reaction by adding 100 µL of Stop Solution to each well. 10.
Determine the optical density of the solution in each well at 450 nm (reading)
and at 620 nm to 630 nm (background subtraction, recommended) with a
microtiter plate reader. It is recommended that the wells be read within 10
minutes after adding the Stop Solution.
6.3 Calculation of Results 1. Calculate the average optical density (OD)
values for each set of standards, controls and patient samples. 2. Using graph
paper, construct a standard curve by plotting the mean OD obtained from each
standard against its
concentration with OD value on the vertical (Y) axis and concentration on the
horizontal (X) axis. 3. Using the mean OD value for each sample determine the
corresponding concentration from the standard curve. 4. Automated method: The
results in the Instructions for Use have been calculated automatically using a
4-Parameter
curve fit. (4-Parameter Rodbard or 4-Parameter Marquardt are the preferred
methods.) Other data reduction functions may give slightly different results.
5. The concentration of the samples can be read directly from this standard
curve. Samples with concentrations higher than that of the highest standard
have to be further diluted or reported as > 100 pg/mL. For the calculation of
the concentrations this dilution factor has to be taken into account.
6.3.1 Example of Typical Standard Curve
The following data is for demonstration only and cannot be used in place of data generations at the time of assay.
Standard
Optical Density (450 nm)
Standard 0 (0 pg/mL)
1.99
Standard 1 (1 pg/mL)
1.80
Standard 2 (5 pg/mL)
1.45
Standard 3 (10 pg/mL)
1.20
Standard 4 (50 pg/mL)
0.48
Standard 5 (100 pg/mL)
0.24
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
7 EXPECTED NORMAL VALUES It is strongly recommended that each laboratory should determine its own normal and abnormal values.
In a study conducted with apparently healthy individuals, using the DRG Salivary Estradiol HS ELISA the following data were observed:
Population
n
Mean (pg/mL)
Median (pg/mL)
2.5th – 97.5th Percentile (pg/mL)
Range (min. – max.) (pg/mL)
Males
58
3.74
3.45
1.26 9.12
0.74 11.46
Females
Pre-menopausal
Follicular phase
26
5.85
3.45
Luteal phase
26
4.28
3.12
1.32 29.35 1.46 14.97
1.08 46.42 1.19 22.94
Post-menopausal
26
5.56
3.03
1.21 28.43
1.02 41.48
Stages of pregnancy
1.Trimester
24
8.27
5.08
2.33 25.29
1.90 28.98
2.Trimester
24
44.16
39.52
7.29 97.68
7.20 97.86
3.Trimester
24
75.35
75.69
23.25 126.49
21.38 149.68
The results alone should not be the only reason for any therapeutic consequences. The results should be correlated to other clinical observations and diagnostic tests.
8 QUALITY CONTROL
Good laboratory practice requires that controls be run with each calibration
curve. A statistically significant number of controls should be assayed to
establish mean values and acceptable ranges to assure proper performance. It
is recommended to use control samples according to state and federal
regulations. The use of control samples is advised to assure the day to day
validity of results. Use controls at both normal and pathological levels. The
controls and the corresponding results of the QC-Laboratory are stated in the
QC certificate added to the kit. The values and ranges stated on the QC sheet
always refer to the current kit lot and should be used for direct comparison
of the results. It is also recommended to make use of national or
international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of
the results. Employ appropriate statistical methods for analysing control
values and trends. If the results of the assay do not fit to the established
acceptable ranges of control materials patient results should be considered
invalid. In this case, please check the following technical areas: Pipetting
and timing devices; photometer, expiration dates of reagents, storage and
incubation conditions, aspiration and washing methods. After checking the
above mentioned items without finding any error contact your distributor or
DRG directly.
9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS
9.1 Assay Dynamic Range The range of the assay is between 0.366 pg/mL 100
pg/mL.
9.2 Specificity of Antibodies (Cross-Reactivity)
The following substances were tested for cross-reactivity of the assay:
Substance
Added Conc. (pg/mL)
Androstenedione
1000
DHEA
1440
Testosterone
1000
Cortisol
80000
17-OHP
1000
Estrone
300
Progesterone
1000
DHT
1000
Estriol
1000
17-a-Ethinylestradiol
20000
Cross-reactivity (%) 0.03 0.00 0.00 0.02 0.03 1.77 0.00 0.00 0.61 0.47
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
9.3 Sensitivity The analytical sensitivity of the DRG ELISA was calculated by subtracting 2 standard deviations from the mean of 20 replicate analyses of Standard 0 and was found to be 0.195 pg/mL.
The Limit of Blank (LoB) is 0.145 pg/mL. The Limit of Detection (LoD) is 0.366 pg/mL. The Limit of Quantification (LoQ) is 0.736 pg/mL.
9.4 Reproducibility
9.4.1 Intra-Assay
The within-assay variability was determined by measuring each sample 10 times per run (n = 10):
Sample n Mean (pg/mL) CV (%)
1
10
2.50
9.4
2
10
4.95
9.4
3
10
26.45
6.3
4
10
92.54
1.4
9.4.2 Inter-Assay
The between-assay variability was determined by measuring each sample 10 times per run for 3 days (n = 30):
Sample n Mean (pg/mL) CV (%)
1
30
2.51
14.9
2
30
5.49
12.3
3
30
29.48
9.4
4
30
93.20
1.7
9.4.3 Inter-Lot
The inter-assay (between-lots) variation was determined by measuring each sample 6 times with 3 different kit lots:
Sample n Mean (pg/mL) CV (%)
1
18
2.67
13.5
2
18
6.82
6.2
3
18
26.35
5. 9
4
18
85.69
5.5
9.5 Recovery
Samples have been spiked by adding estradiol solutions with known concentrations.
The recovery (%) was calculated by multiplying the ratio of measured and expected values with 100.
Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4
Concentration (pg/mL)
6.34
16.63
22.96
71.01
Average Recovery (%)
100.8
87.4
88.8
90.0
Range of Recovery (%)
from to
98.8 104.3
86.8 88.3
87.4 90.4
88.9 91.1
9.6 Linearity
Samples were measured undiluted and in serial dilutions with 0.9 % NaCl. The recovery (%) was calculated by multiplying the ratio of expected and measured values with 100.
Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4
Concentration (pg/mL)
32.02
63.24
65.23
80.89
Average Recovery (%)
97.5
97.7
104.5
101.0
Range of Recovery (%)
from to
89.2 109.9
96.4 100.3
95.2 109.8
91.1 111.0
Version 2.0
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
9.7 Comparison Studies A comparison of DRG Salivary Estradiol HS ELISA
(SLV-6145) (y) and the reference method LC-MS/MS (x) using clinical samples
gave the following correlation:
n = 9 r = 0.980 y = 0.775x + 7.536
A comparison of DRG Salivary Estradiol HS ELISA (SLV-6145) (y) and the IBL
17-Estradiol Saliva ELISA (REF 30121045) (x) using clinical samples gave the
following correlation:
n = 48 r = 0.992 y = 1.691x – 3.462
10 LIMITATIONS OF USE Reliable and reproducible results will be obtained when
the assay procedure is performed with a complete understanding of the package
insert instruction and with adherence to good laboratory practice. Any
improper handling of samples or modification of this test might influence the
results.
10.1 Interfering Substances The following substances will increase the
estradiol values by more than 20 %: coffee, ethanol, coffee with milk,
toothpaste, caffeine, chewing gum, nicotine. In contrast, hemoglobin will
decrease the estradiol values by more than 20%.
10.2 Drug Interferences The Salivary Estradiol HS ELISA should not be used for
patients being treated with the drugs Fulvestrant (Faslodex®) and Mifepristone
(Mifegyne®), since this could lead to falsely elevated results. Patients who
are under treatment with L-Thyroxin may also show falsely elevated test
results. To avoid interference with high dose L-Thyroxin treatment, the
sampling must be done either directly in the morning before taking L-Thyroxin
or at least 12 hours after taking L-Thyroxin.
10.3 High-Dose-Hook Effect A High-Dose-Hook Effect is not known for
competitive assays.
11 LEGAL ASPECTS 11.1 Reliability of Results The test must be performed
exactly as per the manufacturer’s instructions for use. Moreover the user must
strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other
applicable national standards and/or laws. This is especially relevant for the
use of control reagents. It is important to always include, within the test
procedure, a sufficient number of controls for validating the accuracy and
precision of the test. The test results are valid only if all controls are
within the specified ranges and if all other test parameters are also within
the given assay specifications. In case of any doubt or concern please contact
DRG.
11.2 Therapeutic Consequences Therapeutic consequences should never be based
on laboratory results alone even if all test results are in agreement with the
items as stated under point 11.1. Any laboratory result is only a part of the
total clinical picture of a patient. Only in cases where the laboratory
results are in acceptable agreement with the overall clinical picture of the
patient should therapeutic consequences be derived. The test result itself
should never be the sole determinant for deriving any therapeutic
consequences.
11.3 Liability Any modification of the test kit and/or exchange or mixture of
any components of different lots from one test kit to another could negatively
affect the intended results and validity of the overall test. Such
modification and/or exchanges invalidate any claim for replacement. Claims
submitted due to customer misinterpretation of laboratory results subject to
point 11.2 are also invalid. Regardless, in the event of any claim, the
manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any
damage caused to the test kit during transportation is not subject to the
liability of the manufacturer.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
1 ZWECKBESTIMMUNG
Deutsch
Der DRG Salivary Estradiol HS ELISA wird zur quantitativen Bestimmung von aktivem freien Estradiol in Speichel eingesetzt. Nur für In-vitro Diagnostik. Die Ergebnisse können eingesetzt werden bei der Beurteilung von Fertilitätsstörungen bei der Frau, zur Diagnose der Menopause und zur Überwachung bei Hormonersatztherapie.
2 TESTPRINZIP
Der DRG Salivary Estradiol HS ELISA ist ein Festphasen-Enzymimmunoassay, der
auf dem Prinzip der kompetitiven Bindung basiert. Die Wells der
Mikrotiterplatten sind mit einem polyklonalen Antikörper (Kaninchen)
beschichtet, der gegen definierte Antikörper-Bindungsstellen des Estradiol-
Moleküls gerichtet ist. Während der Inkubation konkurriert das Estradiol in
der zugegebenen Probe mit dem Enzymkonjugat (Estradiol, konjugiert an
Meerrettichperoxidase) um die freien Bindungsstellen auf den beschichteten
Wells. Nach einem Waschschritt, um alle ungebundenen Substanzen zu entfernen,
wird die feste Phase mit der Substratlösung inkubiert. Die Farbreaktion wird
durch die Zugabe der Stopplösung beendet und die optische Dichte (OD) des
resultierenden gelben Produktes gemessen. Die Intensität der Farbe ist
umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe. Durch
Auftragen der OD-Werte gegen die Konzentrationen der Standards wird eine
Standardkurve erstellt, und die Konzentrationen der unbekannten Proben werden
anhand dieser Standardkurve bestimmt.
3 VORSICHTSMAßNAHMEN
– Dieser Kit ist nur zum in vitro diagnostischen Gebrauch geeignet. Nur für
den professionellen Gebrauch. – Nur die gültige, im Testkit enthaltene,
Gebrauchsanweisung verwenden. – Informationen zu im Kit enthaltenen
gefährlichen Substanzen entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt. – Alle
Bestandteile dieses Testkits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, wurden
mit FDA-geprüften Methoden
auf HIV I/II, HbsAg und HCV getestet und als negativ bestätigt. Jedoch sollten
alle Bestandteile im Umgang und bei der Entsorgung wie mögliche Gefahrenstoffe
betrachtet werden. – Der Kontakt mit der Stop Solution sollte vermieden
werden, da sie 0,5 M H2SO4 enthält. Schwefelsäure kann Hautreizungen und
Verbrennungen verursachen. – Nicht mit dem Mund pipettieren und den Kontakt
von Kitbestandteilen und Proben mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. – In den
Bereichen, in denen Proben oder Kitbestandteile verwendet werden, nicht
rauchen, essen oder Kosmetika verwenden. – Beim Umgang mit Proben oder
Reagenzien Einweg-Latexhandschuhe tragen. Die Verunreinigung von Reagenzien
oder Proben mit Mikroben kann zu falschen Ergebnissen führen. – Der Gebrauch
sollte gemäß der Vorschriften einer entsprechenden nationalen Gefahrenstoff-
Sicherheitsrichtlinie erfolgen. – Reagenzien nicht nach dem auf dem Kit-
Etikett angegebenen Verfallsdatum verwenden. – Alle im Kit-Protokoll
angegebenen Mengen müssen genau eingehalten werden. Optimale Ergebnisse können
nur durch Verwendung kalibrierter Pipetten und Mikrotiterplatten-Lesegeräte
erreicht werden. – Komponenten von Kits mit unterschiedlichen Lotnummern nicht
untereinander vertauschen. Es wird empfohlen, keine Wells von verschiedenen
Platten zu verwenden, auch nicht, wenn es sich um das gleiche Lot handelt. Die
Kits können unter anderen Bedingungen gelagert oder versendet worden sein, so
dass die Bindungscharakteristik der Platten leicht unterschiedlich ausfällt. –
Chemikalien und zubereitete oder bereits benutzte Reagenzien müssen gemäß den
nationalen Gefahrenstoffvorschriften wie gefährlicher Abfall behandelt werden.
– Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf Anfrage direkt von der
Firma DRG Instruments GmbH erhältlich.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
4 BESTANDTEILE DES KITS 4.1 Kitinhalt 1. Microtiterwells, 96 Wells, 12 x 8
Wells (einzeln brechbar);
Mit anti-Estradiol-Antikörper (polyklonal) beschichtet. 2. Standard (Standard
0 – 5), 6 Fläschchen, je 1 mL, gebrauchsfertig;
Konzentrationen: 0 1 5 10 50 100 pg/mL Die Standards sind gegen das
folgende Referenzmaterial kalibriert: Cerilliant E-060 Enthält
quecksilberfreies Konservierungsmittel. 3. Control Low & High (Kontrolle), 2
Fläschchen, je 1 mL, gebrauchsfertig; Kontrollwerte und -bereiche entnehmen
Sie bitte dem Fläschchenetikett oder dem ,,Certificate of Analysis”. Enthält
quecksilberfreies Konservierungsmittel. 4. Enzyme Conjugate (Enzymkonjugat), 1
Fläschchen, 14 mL, gebrauchsfertig; Estradiol mit Meerrettichperoxidase
konjugiert; Enthält quecksilberfreies Konservierungsmittel. 5. Substrate
Solution (Substratlösung), 1 Fläschchen, 14 mL, gebrauchsfertig;
Substratlösung TMB. 6. Stop Solution (Stopplösung), 1 Fläschchen, 14 mL,
gebrauchsfertig; enthält 0,5 M H2SO4, Kontakt mit der Stopplösung vermeiden!
Kann Hautreizungen und Verbrennungen verursachen. 7. Wash Solution
(Waschlösung), 1 Fläschchen, 30 mL, 40X konzentriert; Siehe ,,Vorbereitung der
Reagenzien”.
4.2 Erforderliche aber nicht enthaltene Geräte und Materialien – Kalibriertes
Mikrotiterplattenlesegerät (450 nm, mit Referenzwellenlänge bei 620 nm bis 630
nm), (z.B. das DRG
Instruments Mikrotiterplattenlesegerät) – Kalibrierte variable Präzisions-
Mikropipetten – Saugfähiges Papier – Destilliertes Wasser – Laborwecker –
Millimeterpapier oder Software zur Datenauswertung
4.3 Lagerung und Haltbarkeit des Kits Die ungeöffneten Reagenzien behalten bei
Lagerung um 2 °C bis 8 °C ihre Reaktivität bis zum Verfallsdatum. Nach dem
Verfallsdatum die Reagenzien nicht mehr verwenden. Nach dem Öffnen sollten
alle Reagenzien bei 2 °C bis 8 °C gelagert werden. Die Mikrotiterwells sollten
bei 2 °C bis 8 °C gelagert werden. Der einmal geöffnete Folienbeutel sollte
stets sehr sorgfältig wieder verschlossen werden. Unter den beschriebenen
Lagerbedingungen behalten geöffnete Kits 8 Wochen ihre Reaktivität.
4.4 Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien sowie die benötigte Anzahl von
Wells sollen vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (20 °C bis 26 °C) gebracht
werden.
Wash Solution Die 40-fach konzentrierte Wash Solution (30 mL) mit 1170 mL
destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1200 mL verdünnen. Die
verdünnte Waschlösung ist bei Raumtemperatur für 1 Woche stabil.
4.5 Entsorgung des Kits Die Entsorgung des Kits und aller verwendeten
Materialien / Reagenzien muss gemäß den nationalen gesetzlichen Vorschriften
erfolgen. Spezielle Informationen für dieses Produkt finden Sie im
Sicherheitsdatenblatt, Abschnitt 13.
4.6 Beschädigte Testkits Im Falle einer Beschädigung des Testkits oder der
Komponenten muss die Firma DRG in schriftlicher Form spätestens eine Woche
nach Erhalt des Kits informiert werden. Beschädigte Einzelkomponenten dürfen
nicht für den Testlauf verwendet werden. Sie müssen aufbewahrt werden, bis
eine endgültige Lösung gefunden wurde. Danach sollten Sie gemäß den
offiziellen Richtlinien entsorgt werden.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
5 PROBENVORBEREITUNG
Speichelproben können in diesem Test als Probenmaterial eingesetzt werden. Die
Probenentnahme muss am Morgen vor der Nahrungsaufnahme, dem Trinken oder
Rauchen erfolgen. Es wird empfohlen, den Mund 5 Minuten vor der Probenentnahme
gründlich mit kaltem Wasser auszuspülen. Falls die Probenentnahme im Laufe des
Tages erfolgen muss, sollte Essen, Trinken, Rauchen, Kaugummi kauen oder Zähne
putzen mindestens 2 Stunden vor der Entnahme vermieden werden. Speichelproben
sollten nicht bei Krankheiten, Entzündungen oder Verletzungen der Mundhöhle
entnommen werden (Blutkontamination). Achtung: Proben, die Natriumazid
enthalten, sollten nicht verwendet werden.
Weitere Informationen finden Sie in den Kapiteln ,,Interferenzen” und
,,Beeinflussung durch Medikamente”.
5.1 Probenentnahme Die Speichelproben müssen gesammelt werden mit SALI-TUBES
100 (REF SLV-4158, erhältlich bei DRG). Andere Sammelsysteme wurden nicht
getestet. Diese müssen in Verantwortung des Anwenders validiert werden.
5.2 Probenaufbewahrung und -vorbereitung Frische Speichelproben Sofort nach
der Ankunft im Labor müssen frische Speichelproben mindestens über Nacht bei
-20 °C tiefgefroren werden. Jede Speichelprobe muss eingefroren, aufgetaut und
anschließend zentrifugiert werden, um Muzine aus der Probe zu entfernen.
Lagerung: sofort bei -20 °C
Danach müssen die eingefrorenen Proben aufgetaut und 5 bis 10 Minuten bei 10
000 g zentrifugiert werden. Anschließend muss der klare Überstand in ein
frisches Röhrchen überführt werden. Nur dieser klare Überstand darf als Probe
im ELISA eingesetzt werden.
Überstand Lagerung: bis zu 7 Tage bei 2 °C bis 8 °C
mindestens 2 Monate bei -20 °C, in Aliquots
Der Überstand sollte nur einmal eingefroren werden. Vor dem Einsatz im Test muss der aufgetaute Überstand durch hin- und herschwenken gemischt werden.
5.3 Probenverdünnung Wenn in einem ersten Testdurchlauf bei einer Probe eine Konzentration höher als der höchste Standard gefunden wird, kann diese Probe mit 0,9% NaCl weiter verdünnt und nochmals bestimmt werden. Die Verdünnung muss jedoch bei der Berechnung der Konzentration beachtet werden.
Beispiel: a) Verdünnung 1:2: b) Verdünnung 1:10:
50 µL Probe + 50 µL 0,9% NaCl gründlich mischen) 10 µL Probe + 90 µL 0,9% NaCl gründlich mischen)
6 TESTDURCHFÜHRUNG
6.1 Allgemeine Hinweise
– Alle Reagenzien und Proben müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht
und gut durchmischt werden. Dabei sollte Schaumbildung vermieden werden.
– Wenn die Testdurchführung einmal begonnen wurde, muss sie ohne Unterbrechung
zu Ende geführt werden. – Für jeden Standard, jede Kontrolle oder Probe eine
neue Plastikspitze verwenden, um Verschleppungen zu
vermeiden. – Die Optische Dichte ist abhängig von Inkubationszeit und
Temperatur. Deshalb ist es notwendig, vor Beginn der
Testdurchführung alle Reagenzien in einen arbeitsbereiten Zustand zu bringen,
die Deckel der Fläschchen zu öffnen, alle benötigten Wells in den Halter zu
setzen. Nur eine solche Vorbereitung garantiert gleiche Zeiten für jeden
Pipettiervorgang ohne Pausen. – Als generelle Regel gilt, dass die
enzymatische Reaktion linear proportional zu Zeit und Temperatur ist.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
6.2 Testdurchführung Jeder Lauf muss eine Standardkurve beinhalten.
1. Die benötigte Anzahl Wells in der Halterung befestigen. 2. Je 100 µL
Standard, Control und Probe mit neuen Plastikspitzen in die entsprechenden
Wells geben. 3. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. 100 µL Enzyme
Conjugate in jedes Well geben.
Für 10 Sekunden gut schütteln. Es ist sehr wichtig, in diesem Schritt eine
komplette Durchmischung zu erreichen. 5. 60 Minuten bei Raumtemperatur
inkubieren. 6. Wells 3-mal mit 400 µL verdünnter Wash Solution waschen, falls
ein Waschautomat verwendet wird.
– ODER Den Inhalt der Wells kräftig ausschütteln. Wells 3-mal mit 300 µL
verdünnter Wash Solution waschen bei manueller Durchführung. Verbleibende
Flüssigkeit durch Ausklopfen der Wells auf saugfähigem Papier entfernen.
Achtung: Die Sensitivität und Präzision dieses Assays wird erheblich
beeinflusst von der korrekten Durchführung des Waschschrittes! 7. 100 µL
Substrate Solution in jedes Well geben. 8. 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubieren. 9. Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 100 µL Stop Solution
in jedes Well abstoppen. 10. Die Optische Dichte (OD) bei 450 nm (Messung) und
620 nm bis 630 nm (Abzug des Hintergrundes, empfohlen) mit einem
Mikrotiterplattenleser innerhalb von 10 Minuten nach Zugabe der Stop Solution
bestimmen.
6.3 Ergebnisermittlung 1. Die durchschnittlichen Werte der Optischen Dichte
(OD) für jedes Set von Standards, Controls und Patientenproben
bestimmen. 2. Eine Standardkurve ermitteln durch Auftragen der mittleren
Optischen Dichte jedes Standards gegen die
Konzentration, wobei der OD-Wert auf der vertikalen (Y) Achse und die
Konzentration auf der horizontalen (X) Achse eingetragen wird. 3. Unter
Verwendung der mittleren OD wird für jede Probe die entsprechende
Konzentration aus der Standardkurve ermittelt. 4. Automatische Methode: Die in
der Gebrauchsanweisung angegebenen Werte wurden automatisch mit Hilfe der 4
-Parameter-Gleichung bestimmt. (4-Parameter-Rodbard oder 4-Parameter-Marquardt
sind die bevorzugten Methoden.) Andere Auswertungsfunktionen können leicht
abweichende Werte ergeben. 5. Die Konzentration der Proben kann direkt von der
Standardkurve abgelesen werden. Proben, die eine höhere Konzentration als die
des höchsten Standards enthalten, müssen verdünnt werden. Dieser
Verdünnungsfaktor muss bei der Berechnung der Konzentration beachtet werden.
6.3.1 Beispiel für eine Standardkurve
Nachfolgend wird ein typisches Beispiel für eine Standardkurve mit dem DRG ELISA gezeigt. Diese Werte sollten nicht zur Berechnung von Patientendaten verwendet werden.
Standard
Optische Dichte (450 nm)
Standard 0 (0 pg/mL)
1,99
Standard 1 (1 pg/mL)
1,80
Standard 2 (5 pg/mL)
1,45
Standard 3 (10 pg/mL)
1,20
Standard 4 (50 pg/mL)
0,48
Standard 5 (100 pg/mL)
0,24
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
7 ERWARTETE WERTE Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen normalen und abnormalen Werte ermittelt.
In einer Studie mit dem DRG Salivary Estradiol HS ELISA wurden die Proben von scheinbar gesunden Probanden untersucht. Dabei ergaben sich folgende Werte:
Population
n
Mittelwert (pg/mL)
Median (pg/mL)
2,5. – 97,5. Perzentile (pg/mL)
Bereich (min. – max.) (pg/mL)
Männer
58
3,74
3,45
1,26 9,12
0,74 11,46
Frauen
Pre-menopausal
Follikelphase
26
5,85
3,45
1,32 29,35
1,08 46,42
Lutealphase
26
4,28
3,12
1,46 14,97
1,19 22,94
Post-menopausal
26
5,56
3,03
Schwangerschaft
1,21 28,43
1,02 41,48
1.Trimester
24
8,27
5,08
2,33 25,29
1,90 28,98
2.Trimester
24
44,16
39,52
7,29 97,68
7,20 97,86
3.Trimester
24
75,35
75,69
23,25 126,49
21,38 149,68
Die mit diesem Testkit erzielten Ergebnisse sollten niemals als alleinige Grundlage für therapeutische Konsequenzen dienen. Die Ergebnisse müssen zusammen mit anderen klinischen Befunden und diagnostischen Tests des Patienten interpretiert werden.
8 QUALITÄTSKONTROLLE
Es wird empfohlen, die Kontrollproben gemäß den nationalen gesetzlichen
Bestimmungen einzusetzen. Durch die Verwendung von Kontrollproben wird eine
Tag-zu-Tag Überprüfung der Ergebnisse erzielt. Es sollten Kontrollen sowohl
mit normalem als auch pathologischem Level eingesetzt werden. Die Kontrollen
mit den entsprechenden Ergebnissen des QC-Labors sind im QC-Zertifikat, das
dem Kit beiliegt, aufgeführt. Die im QC-Blatt angegebenen Werte und Bereiche
beziehen sich stets auf die aktuelle Kitcharge und sollten zum direkten
Vergleich der Ergebnisse verwendet werden. Es wird ebenfalls empfohlen, an
nationalen oder internationalen Qualitätssicherungs-Programmen teilzunehmen,
um die Genauigkeit der Ergebnisse zu sichern. Es sollten geeignete
statistische Methoden zur Analyse von Kontroll-Werten und Trends angewendet
werden. Wenn die Ergebnisse des Assays nicht mit den angegebenen
Akzeptanzbereichen des Kontrollmaterials übereinstimmen, sollten die
Patientenergebnisse als ungültig eingestuft werden. In diesem Fall überprüfen
Sie bitte die folgenden Bereiche: Pipetten und Zeitnehmer, Photometer,
Verfallsdatum der Reagenzien, Lagerungs- und Inkubationsbedingungen, Absaug-
und Waschmethode. Sollten Sie nach Überprüfung der vorgenannten Bereiche
keinen Fehler erkannt haben, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Lieferanten oder
direkt mit der Firma DRG in Verbindung.
9 ASSAY-CHARAKTERISTIKA 9.1 Messbereich Der Messbereich des Testes liegt
zwischen 0,366 pg/mL 100 pg/mL.
9.2 Spezifität der Antikörper (Kreuzreaktivität) entnehmen Sie bitte der
ausführlichen englischen Version der Gebrauchsanweisung.
9.3 Sensitivität Die analytische Sensitivität, definiert als Mittelwert,
abzüglich der zweifachen Standardabweichung, des Standard 0 (n = 20), beträgt
0,195 pg/mL.
Der ,,Limit of Blank” (LoB) ist 0,145 pg/mL. Die Nachweisgrenze (LoD) ist
0,366 pg/mL. Die Quantifizierungsgrenze (LoQ) ist 0,736 pg/mL.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
Die Daten zu: 9.4 Reproduzierbarkeit (Präzision) 9.5 Wiederfindung 9.6
Linearität 9.7 Methodenvergleich entnehmen Sie bitte der ausführlichen
englischen Version der Gebrauchsanweisung.
10 GRENZEN DES TESTS Zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse werden
erzielt, wenn das Testverfahren mit vollständigem Verständnis der Anweisungen
in der Gebrauchsanleitung und unter Befolgung der GLP (Good Laboratory
Practice)-Richtlinien durchgeführt wird. Jede unsachgemäße Behandlung von
Proben oder Modifikation dieses Tests können die Ergebnisse beeinflussen.
10.1 Interferenzen Folgende Substanzen erhöhen die Estradiolwerte um mehr als
20 %: Kaffee, Ethanol, Milchkaffee, Zahnpasta, Koffein, Kaugummi, Nikotin. Im
Gegensatz dazu bewirkt Hämoglobin eine Verminderung der Estradiolwerte um mehr
als 20 %.
10.2 Beeinflussung durch Medikamente Der Salivary Estradiol HS ELISA sollte
nicht bei Patienten angewendet werden, die mit den Medikamenten Fulvestrant
(Faslodex®) und Mifepriston (Mifegyne®) behandelt werden, da dies zu falsch
erhöhten Ergebnissen führen könnte. Auch bei Patienten, die mit L-Thyroxin
behandelt werden, können falsch erhöhte Testergebnisse auftreten. Um
Interferenzen mit hochdosierter L-Thyroxin-Behandlung zu vermeiden, muss die
Probenahme entweder direkt am Morgen vor der Einnahme von L-Thyroxin oder
mindestens 12 Stunden nach der Einnahme von L-Thyroxin erfolgen.
10.3 High-Dose-Hook Effekt Ein Hook-Effekt ist für kompetitive Assays nicht
bekannt.
11 RECHTLICHE GRUNDLAGEN 11.1 Zuverlässigkeit der Ergebnisse Der Test muss
exakt gemäß der Testanleitung des Herstellers abgearbeitet werden. Darüber
hinaus muss der Benutzer sich strikt an die Regeln der GLP (Good Laboratory
Practice) oder andere eventuell anzuwendende Regeln oder nationale gesetzliche
Vorgaben halten. Dies betrifft besonders den Gebrauch der Kontrollreagenzien.
Es ist sehr wichtig, bei der Testdurchführung stets eine ausreichende Anzahl
Kontrollen zur Überprüfung der Genauigkeit und Präzision mitlaufen zu lassen.
Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn alle Kontrollen in den vorgegebenen
Bereichen liegen, und wenn alle anderen Testparameter die vorgegebenen
Spezifikationen für diesen Assay erfüllen. Wenn Sie bezüglich eines
Ergebnisses Zweifel oder Bedenken haben, setzen Sie sich bitte mit der Firma
DRG in Verbindung.
11.2 Therapeutische Konsequenzen Therapeutische Konsequenzen sollten
keinesfalls nur aufgrund von Laborergebnissen erfolgen, selbst dann nicht,
wenn alle Testergebnisse mit den in 11.1 genannten Voraussetzungen
übereinstimmen. Jedes Laborergebnis ist nur ein Teil des klinischen
Gesamtbildes eines Patienten. Nur in Fällen, in denen die Laborergebnisse in
akzeptabler Übereinstimmung mit dem allgemeinen klinischen Bild des Patienten
stehen, sollten therapeutische Konsequenzen eingeleitet werden. Das
Testergebnis allein sollte niemals als alleinige Grundlage für die Einleitung
therapeutischer Konsequenzen dienen.
11.3 Haftung Jegliche Veränderungen des Testkits und/oder Austausch oder
Vermischung von Komponenten unterschiedlicher Chargen von einem Testkit zu
einem anderen, können die gewünschten Ergebnisse und die Gültigkeit des
gesamten Tests negativ beeinflussen. Solche Veränderungen und/oder Austausch
haben den Ausschluss jeglicher Ersatzansprüche zur Folge. Reklamationen, die
aufgrund von Falschinterpretation von Laborergebnissen durch den Kunden gemäß
Punkt 11.2 erfolgen, sind ebenfalls abzuweisen. Im Falle jeglicher Reklamation
ist die Haftung des Herstellers maximal auf den Wert des Testkits beschränkt.
Jegliche Schäden, die während des Transports am Kit entstanden sind,
unterliegen nicht der Haftung des Herstellers.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
1 DESTINAZIONE D’USO
Italiano
Il test immuno-enzimatico DRG Salivary Estradiol HS ELISA contiene materiale per la determinazione quantitativa di dell’estradiolo attivo libero nella saliva. Solo per uso diagnostico in vitro. I risultati possono essere utilizzati per valutare i problemi di fertilità nelle donne, per diagnosticare la menopausa e per monitorare la terapia ormonale sostitutiva.
2 PRINCIPIO DEL TEST
Il test kit DRG Salivary Estradiol HS ELISA è un test immunologico in fase
solida con enzimi ancorati su un substrato (ELISA), basato sul principio del
legame competitivo. I micropozzetti sono ricoperti con un anticorpo
policlonale diretto contro i siti antigenici della molecola di estradiolo.
Durante l’incubazione, l’estradiolo nel campione aggiunto compete con il
coniugato enzimatico aggiunto, che è estradiolo coniugato con perossidasi di
rafano, per il legame con l’anticorpo rivestito. Dopo una fase di lavaggio per
rimuovere tutte le sostanze non legate, la fase solida viene incubata con la
soluzione di substrato. La reazione colorimetrica viene bruscamente interrotta
con l’aggiunta di soluzione di arresto e viene misurata la densità ottica (DO)
del prodotto giallo risultante. L’intensità del colore è inversamente
proporzionale alla concentrazione dell’analita nel campione. Una curva
standard viene costruita tracciando i valori di DO rispetto alle
concentrazioni di standard, e le concentrazioni di campioni sconosciuti
vengono determinate usando questa curva standard.
3 PRECAUZIONI
– Questo kit è adatto soltanto per l’uso diagnostico in vitro. Solo per l’uso
professionale. – Si prega di usare la versione valida dell’inserto del pacco a
disposizione con il kit. – Informazioni su sostanze pericolose contenute nel
kit sono riportate nel regolamento di sicurezza. – Tutti i componenti del kit
che contengono siero o plasma umano sono controllati e confermati negativi per
la presenza
di HIV I/II, HbsAg e HCV con metodi conformi alle norme FDA. Ciononostante
tutti i componenti dovrebbero essere trattati come potenziali sostanze nocive
nella manutenzione e nello smaltimento. – Il contatto con la Stop Solution
dovrebbe essere evitato perché contiene 0,5 M H2SO4. L’acido solforico può
provocare irritazioni cutanee e ustioni. – Non pipettare con la bocca ed
evitare il contatto con componenti del kit con la pelle o con le mucose. –
Nelle aree in cui il test viene utilizzato non fumare, mangiare, bere o fare
uso di prodotti cosmetici. – Nella manutenzione dei campioni o reagenti del
kit portare guanti di latex monouso. La contaminazione dei reagenti o dei
campioni con microbi può dare risultati falsi.
– L’utilizzo dovrebbe avvenire secondo regole che seguono le rispettive norme
di sicurezza nazionali sulle sostanze nocive.
– Non utilizzare i reagenti dopo la scadenza indicata sul kit. – Ogni
indicazione sulla quantità indicata del protocollo del kit deve essere
accuratamente seguito. Risultati ottimali
possono essere ottenuti soltanto con l’uso di pipette calibrate e
spettrofotometro calibrato. – Componenti del kit con numeri di lotto diversi
non devono essere combinati. È consigliabile di non utilizzare pozzetti di
piastre diversi, anche se si tratta dello stesso lotto. I kit potrebbero
essere stati magazzinati o spediti a condizioni diverse, cosicché le
caratteristiche di legame potrebbero divergere leggermente. – I componenti
chimici e reagenti preparati o già utilizzati devono essere trattati e
smaltiti secondo le norme di sicurezza nazionali sulle sostanze nocive. – I
regolamenti di sicurezza di questo prodotto possono essere richiesti
direttamente dalla ditta DRG Instruments GmbH.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
4 COMPONENTI DEL KIT 4.1 Contenuto del kit 1. Microtiterwells (Micropozzetti),
12 x 8 file (separatamente staccabili), 96 pozzetti;
Pozzetti ricoperti con l’anti-estradiolo anticorpo (policlonale) 2. Standard
(Standard 0 – 5), 6 flaconi, 1 mL ognuno, pronto all’uso;
Concentrazione: 0 1 5 10 50 100 pg/mL Gli standard sono
standardizzati contro il seguente materiale di riferimento: Cerilliant E-060.
Contiene conservante senza mercurio. 3. Control Low & High (Controllo), 2
flaconi, 1 mL ognuno, pronto all’uso; Per i valori e gli intervalli di
controllo si prega di fare riferimento all’etichetta della fiala o al
certificato di analisi. Contiene conservante senza mercurio. 4. Enzyme
Conjugate (Tracciante enzimatico), 1 flacone,14 mL, pronto all’uso; Estradiolo
coniugato alla perossidasi di rafano; Contiene conservante senza mercurio. 5.
Substrate Solution (Soluzione di substrato), 1 flacone, 14 mL, pronto all’uso;
TMB (benzidine tetrametilico). 6. Stop Solution (Soluzione d’arresto), 1
flacone, 14 mL, pronto all’uso; Contiene 0,5 M H2SO4. Evitare il contatto con
la soluzione d’arresto. Può causare irritazioni cutanee e ustioni. 7. Wash
Solution (Soluzione di lavaggio), 1 flacone, 30 mL (concentrata 40X); vedi
,,preparazione dei reagenti”.
4.2 Materiali richiesti ma non contenuti nel kit – Lettore di piastre di
microtitolazione calibrato (450 nm, con lunghezza d’onda di riferimento a 620
nm a 630 nm)
(p.es. il DRG Instruments Microtiterplate Reader) – Micropipette calibrate di
precisione a volume variabile – Carta assorbente – Acqua distillata – Timer –
Carta millimetrata o software per il calcolo dei dati
4.3 Magazzinaggio e stabilità del kit A 2 °C a 8 °C i reagenti non aperti
rimangono reattivi fino alla data di scadenza indicata. Non usare reagenti
oltre questa data. Tutti i reagenti aperti devono essere magazzinati a 2 °C a
8 °C. I micropozzetti devono essere magazzinati a 2 °C a 8 °C. Una volta
aperti i pacchi, questi devono essere richiusi accuratamente. Test kits aperti
rimangono attivi per 8 settimane se magazzinati alle condizioni sopra
descritte.
4.4 Preparazione dei reagenti Prima dell’uso portare tutti i reagenti e il
numero necessario di pozzetti a temperatura ambiente (20 °C a 26 °C).
Wash Solution Diluire 30 mL Wash Solution concentrata con 1170 mL di acqua
distillata fino ad un volume finale di 1200 mL. La soluzione di lavaggio
diluita è stabile per 1 settimana a temperatura ambiente.
4.5 Smaltimento del kit La discarica del kit e di tutti i materiali/reagenti
usati devono avvenire secondo i regolamenti nazionali. Informazioni aggiuntive
per questo prodotto si trovano nel scheda di dati di sicurezza, sezione 13.
4.6 Test kits danneggiati In caso di alcun danno al test kit o ai suoi
component, DRG deve essere informato per iscritto, al Massimo una settimana
dopo la ricevuta del kit. Componenti singoli danneggiati non devono essere
usati per un saggio. Questi devono essere conservati fino ad aver trovato una
soluzione finale. Dopo, questi componenti devono essere scaricati secondo i
regolamenti ufficiali.
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5 CAMPIONI
La saliva può essere utilizzata in questo test. Il prelievo deve essere
effettuato la mattina prima dell’assunzione di cibo, bere o fumare. Si
consiglia di sciacquare la bocca accuratamente con acqua fredda 5 minuti prima
del campionamento. Se il campionamento deve essere effettuato durante il
giorno, è necessario evitare di mangiare, bere, fumare, masticare gomme o
lavarsi i denti almeno 2 ore prima del campionamento. Non raccogliere campioni
in presenza di malattie orali, infiammazioni o lesioni (contaminazione del
sangue). Nota: i campioni contenenti sodio azide non devono essere utilizzati
nel test.
Fare riferimento ai capitoli “Sostanze interferenti” e ” Droghe interferenti”.
5.1 Collezione dei campioni I campioni di saliva devono essere raccolti utilizzando SALI-TUBES 100 (REF SLV-4158, disponibile presso DRG). Altri dispositivi di campionamento della saliva non sono stati testati e devono essere convalidati sotto la responsabilità dell’utente.
5.2 Conservazione e preparazione dei campioni
Campioni di saliva fresca
Immediatamente dopo l’arrivo in laboratorio, i campioni di saliva fresca devono essere congelati almeno per una notte a -20 °C.
Ogni campione di saliva deve essere congelato, scongelato e centrifugato per separare le mucine mediante centrifugazione.
Conservazione:
immediatamente a -20 °C
Quindi i campioni devono essere scongelati e centrifugati per 5 a 10 minuti a 10 000 g. Successivamente, il supernatante trasparente deve essere trasferito in una nuova provetta. Solo questo supernatante chiaro può essere utilizzato come campione per l’ELISA.
Se deve essere testato un set di più campioni, il laboratorio deve miscelare aliquote del supernatante dei 5 campioni singoli in un dispositivo di campionamento separato ed eseguire il test da questa miscela.
Supernatante Conservazione:
fino a 7 giorni a 2 °C a 8 °C almeno 2 mesi a -20 °C, in aliquote
Il supernatante dovrebbe essere congelato solo una volta. Il supernatante scongelato deve essere invertito più volte prima del test!
5.3 Diluizione dei campioni Se in un campione di siero viene trovata una concentrazione oltre lo standard più alto, questo campione può essere diluito con 0,9% NaCl e nuovamente determinato. Della diluizione deve essere però tenuto conto.
Esempio: a) diluizione 1:2: b) diluizione 1:10:
50 µL campione + 50 µL 0,9% NaCl (agitare bene) 10 µL campione + 90 µL 0,9% NaCl (agitare bene)
6 ATTUAZIONE DEL TEST
6.1 Indicazioni generali
– Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente e
ben mescolati prima dell’uso. Evitare la formazione di schiume.
– Una volta iniziato il procedimento del test, questo deve essere portato alla
fine senza interruzione. – Per ogni componente, standard, controllo o campione
è necessario utilizzare una nuova punta monouso per evitare
reazioni incrociate. – La densità ottica dipende dal tempo d’incubazione e
dalla temperatura. Perciò si rende necessario di preparare tutti i
reagenti, di aprire i tappi dei flaconi e di appostare tutti i pozzetti nelle
appropriate posizioni. Soltanto una tale preparazione garantisce gli stessi
tempi per ogni processo di pipettamento. – Come regola generale vale che la
reazione enzimatica si svolge linearmente proporzionale con il tempo e con la
temperatura.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
6.2 Eseguimento del test Ogni analisi deve includere una curva standard.
1. Fissare i pozzetti necessari sul supporto. 2. Pipettare 100 µL ciascuno di
Standard, Control e campioni nei pozzetti appropriati, cambiando ogni volta la
punta
monouso. 3. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. 4. Pipettare 100 µL
Enzyme Conjugate in ogni pozzetto.
Agitare bene per 10 secondi. È molto importante raggiungere un completo
mescolamento. 5. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. 6. Lavare i
pozzetti 3 volte con 400 µL Wash Solution diluita in ogni pozzetto, se si
utilizza una piastra di lavaggio.
– OPPURE Rovesciare la piastra per vuotare i pozzetti. Lavare i pozzetti 3
volte con 300 µL Wash Solution diluita in ogni pozzetto per il lavaggio
manuale. Rimuovere le gocce d’acqua rimanenti rivoltando la piastra su carta
assorbente. Importante: La sensibilità e la precisazione di questo kit sono
fortemente influenzate dal corretto eseguimento del lavaggio! 7. Aggiungere
100 µL della Substrate Solution ad ogni pozzetto. 8. Incubare per 30 minuti a
temperatura ambiente. 9. Fermare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µL
della Stop Solution ad ogni pozzetto. 10. Determinare la densità ottica (DO)
della soluzione in ogni pozzetto a 450 nm (lettura) e a 620 nm a 630 nm
(sottrazione dello sfondo, raccomandata) con un lettore di piastre di
microtitolazione. Si raccomanda di leggere i pozzetti entro 10 minuti
dall’aggiunta della Stop Solution.
6.3 Rilevamento dei risultati 1. Determinare i valori medi della densità
ottica (DO) per ogni set di standard, controlli e campioni. 2. Costruire una
curva standard: riportare i valori medi della densità ottica (DO) di ogni
standard contro la rispettiva
concentrazione dove i valori delle DO si devono trovare sull’asse verticale
(Y) e le concentrazioni sull’asse orizzontale (X). 3. Utilizzando il valore
medio delle DO per ogni campione si determina la rispettiva concentrazione
dalla curva standard. 4. Metodo automatico: I valori riportati in questo
istruzioni per l’uso sono stati determinati tramite l’equazione a 4-parametri.
(I methodi preferiti sono 4-Parameter Rodbard oppure 4-Parameter Marquardt.)
Altri funzioni usati per l’elaborazioni dei dati possono dare risultati
leggermente differenti. 5. La concentrazione dei campioni può essere
determinata direttamente dalla curva standard. Campioni con una concentrazione
più elevata dello standard più concentrato devono essere diluiti. Di questo
fattore di diluizione deve essere tenuto conto per il calcolo della
concentrazione.
6.3.1 Esempio di una curva standard tipica
I seguenti dati sono a scopo dimostrativo soltanto e non possono sostituire i dati generati dall’eseguimento del test.
Standard
Densità ottiche (450 nm)
Standard 0 (0 pg/mL)
1,99
Standard 1 (1 pg/mL)
1,80
Standard 2 (5 pg/mL)
1,45
Standard 3 (10 pg/mL)
1,20
Standard 4 (50 pg/mL)
0,48
Standard 5 (100 pg/mL)
0,24
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7 VALORI NORMALI È consigliabile che ogni laboratorio determini i propri
valori normali e anormali.
In uno studio condotto con soggetti apparentemente sani, usando il DRG
Salivary Estradiol HS ELISA, i seguenti valori sono stati trovati:
Popolazione
Uomini Uomini Pre-menopausa
Fase follicolare Fase luteale Post menopausa Gravidanza 1° trimestre 2°
trimestre 3° trimestre
n
Media (pg/mL)
Mediano (pg/mL)
2,5. – 97,5. percentile (pg/mL)
Intervallo (min. – max.) (pg/mL)
58
3,74
3,45
1,26 9,12
0,74 11,46
26
5,85
26
4,28
26
5,56
24
8,27
24
44,16
24
75,35
3,45 3,12 3,03
5,08 39,52 75,69
1,32 29,35 1,46 14,97 1,21 28,43
2,33 25,29 7,29 97,68 23,25 126,49
1,08 46,42 1,19 22,94 1,02 41,48
1,90 28,98 7,20 97,86 21,38 149,68
Come per tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe basarsi sui risultati di un singolo dosaggio. Una diagnosi clinica dovrebbe essere formulata dal medico in seguito ad un’attenta valutazione di tutti gli aspetti clinici assieme ai dati di laboratorio.
8 CONTROLLO QUALITÀ
È consigliabile utilizzare i campioni controllo secondo le norme di legge.
Attraverso l’utilizzo dei campioni controllo si può raggiungere una verifica
dei risultati giorno per giorno. Dovrebbero essere adoperati campioni
controllo sia con un livello normale sia con uno patologico. Le referenze con
i rispettivi risultati del laboratorio QC sono elencati nel QC certificato,
che è allegato al kit. I valori riportati nel QC certificato si riferiscono al
lotto del kit attuale e dovrebbero essere utilizzati per un raffronto dei
risultati. È altresì consigliabile di partecipare a programmi di sicurezza
sulla qualità nazionali o internazionali, per assicurarsi dell’esattezza dei
risultati. Appropriati metodi statistici per l’analisi dei valori controllo e
delle rappresentazioni grafici dovrebbero essere adoperati. Nel caso che i
risultati del test non combaciano con il campo di accettazione indicato dal
materiale di controllo, i risultati dei pazienti devono essere considerati
invalidi. In questo caso si prega di controllare i seguenti fattori d’errore:
pipette, cronometri, fotometro, data di scadenza dei reagenti, condizione di
magazzinaggio e d’incubazione, metodi di aspirazione e di lavaggio. Se dopo il
controllo dei suddetti fattori non è rilevabile alcun errore, si prega di
contattare il fornitore o direttamente la ditta DRG.
9 CARATTERISTICHE DEL TEST 9.1 Assay Dynamic Range Le concentrazioni
determinabili con questo test stanno tra 0,366 pg/mL 100 pg/mL.
9.2 Specificità degli anticorpi (reazioni ad incrocio) Per dettagli più
precisi consultare la metodica in inglese.
9.3 Sensitività analitica La sensitività analitica è stata calcolata dai
valori medi, meno due deviazione standard, di venti (20) repliche dello
Standard 0 ed erano 0,195 pg/mL.
Il limite del bianco (LoB) è 0,145 pg/mL. Il limite di rilevabilità (LoD) è
0,366 pg/mL. Il limite di quantificazione (LoQ) è 0,736 pg/mL.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
Dati dettagliati su 9.4 Precisione 9.5 Recupero 9.6 Linearità 9.7 Comparazione
metodica
si prega di consultare le dettagliate istruzioni per l’uso in inglese.
10 LIMITAZIONE DEL TEST Risultati affidabili e riproducibili saranno ottenuti
quando il procedimento del test è seguito con una comprensione completa delle
istruzioni all’uso e seguendo una buona pratica di laboratorio (GLP). Ogni
manutenzione impropria dei campioni o modificazione al saggio può influenzare
i risultati.
10.1 Sostanze interferenti Le seguenti sostanze aumenteranno i valori di
estradiolo di oltre il 20%: caffè, etanolo, caffè con latte, dentifricio,
caffeina, chewing gum, nicotina. Al contrario, l’emoglobina ridurrà i valori
di estradiolo di oltre il 20%.
10.2 Droghe interferenti Il Salivary Estradiol HS ELISA non deve essere
utilizzato per i pazienti in trattamento con i farmaci Fulvestrant (Faslodex®)
e Mifepristone (Mifegyne®), poiché ciò potrebbe portare a risultati falsamente
elevati. I pazienti che sono in trattamento con L-tiroxina possono anche
mostrare risultati del test falsamente elevati. Per evitare interferenze con
il trattamento ad alte dosi di L-tiroxina, il campionamento deve essere
effettuato direttamente al mattino prima di assumere L-tiroxina o almeno 12
ore dopo l’assunzione di L-tiroxina.
10.3 Effetto Hook (Gancio) ad alto dosaggio Un effetto ad alto dosaggio non è
noto per i test competitivi.
11 ASPETTI LEGALI 11.1 Affidabilità dei risultati Il test deve essere eseguito
esattamente secondo il protocollo dato dal produttore. Inoltre l’utente deve
seguire le regole del GLP (Good Laboratory Practice) o eventualmente altre
regole comportamentali o disposizioni legali. Questo vale soprattutto per
l’uso delle referenze. È molto importante utilizzare un numero appropriato di
referenze in parallelo ai campioni test per poter controllare l’esattezza e la
precisione del test. I risultati del test sono validi soltanto se tutte le
referenze cadono nei margini prestabiliti e se tutti gli altri parametri del
test soddisfano la specificazione per questo test. Se esistono dubbi o domande
su questi risultati, si prega di contattare la ditta DRG.
11.2 Conseguenze terapeutiche Soltanto sulla base dei risultati dei laboratori
non dovrebbero essere intraprese delle conseguenze terapeutiche di alcun tipo,
anche se i risultati del test sono d’accordo con gli aspetti articolati nel
punto 11.1. Ogni risultato di laboratorio è soltanto una parte di un quadro
clinico completo di un paziente. Soltanto in casi in cui i risultati di un
test del laboratorio si accordano con il quadro clinico dell’ammalato, si
possono intraprendere delle conseguenze terapeutiche. Il risultato del test da
solo non è base sufficiente per lo stabilimento di una terapia.
11.3 Responsabilità legali Ogni cambiamento del protocollo del test e/o lo
scambio o il mescolamento di componenti provenienti da cariche diverse possono
influenzare negativamente i risultati e compromettere la validità del test.
Questi cambiamenti e/o scambi annullano ogni diritto al risarcimento. Si
respingano inoltre tutti i richiami risultanti da interpretazioni sbagliate da
parte dell’utente secondo il paragrafo 11.2. Nel caso di reclamazione, la
garanzia del produttore è limitato al valore massimo del test kit. Ogni danno
provocato durante il trasporto del kit non sottostà alla responsabilità del
produttore.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
Español
1 FINALIDAD PREVISTA El Kit de inmunoensayo enzimático DRG Salivary Estradiol
HS ELISA proporciona los materiales necesarios para la determinación
cuantitativa del estradiol libre activo en la saliva. Este ensayo está
diseñado solo para diagnóstico in vitro. Los resultados se pueden utilizar
para evaluar los problemas de fertilidad en las mujeres, para diagnosticar la
menopausia y para controlar la terapia de reemplazo hormonal.
2 FUNDAMENTO DEL ENSAYO El Kit DRG Salivary Estradiol HS ELISA es un ensayo en
fase sólida de inmunoadsorción unido a enzimas (ELISA), basado en el principio
de unión competitiva. Los pocillos de la placa están recubiertos con un
anticuerpo policlonal dirigido contra los sitios antigénicos de la molécula
estradiol. Durante la incubación, el estradiol en la muestra agregada compite
con el conjugado enzimático agregado, que es estradiol conjugado con
peroxidasa de rábano, por unirse al anticuerpo recubierto. Después de un paso
de lavado para eliminar todas las sustancias no ligadas, la fase sólida se
incuba con la solución de sustrato. La reacción colorimétrica se detiene
mediante la adición de la solución de parada, y se mide la densidad óptica
(OD) del producto amarillo resultante. La intensidad del color es inversamente
proporcional a la concentración del analito en la muestra. Se construye una
curva estándar trazando los valores de DO frente a las concentraciones de los
estándares, y las concentraciones de las muestras desconocidas se determinan
utilizando esta curva estándar.
3 PRECAUCIONES – Este kit es solamente para diagnóstico in vitro. Solo para
uso profesional. – Por favor, se usa solo la version valida de la metodico
técnico incluido aqui en el kit. – Para obtener información de las sustancias
peligrosas incluidas en el kit por favor mirar las hojas de los datos de
seguridad del material. – Todos los reactivos en este kit de ensayo que
contienen suero o plasma humano se han ensayado y confirmado ser
negativos para HIV I/II, HBsAg y HCV mediante procedimientos aprobados por la
FDA. Sin embargo, todos los reactivos deben ser tratados tanto en su uso como
dispensación como potencialmente biopeligrosos. – Evitar contacto con Stop
Solution que contiene H2SO4 0,5 M. Puede provocar irritación y quemaduras en
la piel. – Nunca pipetear con la boca y evitar el contacto de los reactivos y
las muestras con la piel y con membranas mucosas. – No fumar, comer, beber o
usar cosméticos en áreas donde las muestras o los reactivos del kit están
siendo usados. – Usar guantes de látex cuando se utilicen las muestras y los
reactivos. La contaminación microbiana de los reactivos o las muestras puede
dar resultados erróneos. – El manejo debe realizarse de acuerdo a los
procedimientos definidos por las guías o regulación nacionales de seguridad de
sustancias biopeligrosas. – No utilizar los reactivos después de su fecha de
caducidad que aparece en las etiquetas del kit. – Todos los volúmenes
indicados han de ser realizados de acuerdo con el protocolo. Los resultados
óptimos del ensayo se obtienen solo cuando se utilizan pipetas y lectores de
microplacas calibrados. – No mezclar o usar componentes de kits con distinto
número de lote. Se recomienda no intercambiar pocillos de distintas placas
incluso si son del mismo lote. Los kits pueden haber sido enviados o
almacenados bajo diferentes condiciones y las características de unión de las
placas pueden resultar diferentes. – Los compuestos químicos y los reactivos
preparados o utilizados han de tratarse como residuos peligrosos de acuerdo
con las guías o regulación nacionales de seguridad de sustancias
biopeligrosas. – Las hojas de los datos de seguridad de este producto están
disponibles bajo pedido directamente a DRG Instruments GmbH.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
4 COMPONENTES DEL KIT 4.1 Componentes del Kit 1. Microtiterwells (Placas
multipocillo), 12 x 8 tiras separables, 96 pocillos;
Pocillos recubiertos con anticuerpo anti-estradiol (policlonal). 2. Standard
(Standard 0 – 5), (Estándar), 6 viales, 1 mL cada, listos para usar;
Concentraciones: 0 1 5 10 50 100 pg/mL Los estándares están
calibrado contra el siguiente material de referencia: Cerilliant E-060
Contiene conservante sin mercurio. 3. Control Low & High (Control), 2 viales,
1 mL cada, listos para usar; Para los valores y rangos de control, por favor
consulte la etiqueta del frasco o el Certificado de Análisis. Contiene
conservante sin mercurio. 4. Enzyme Conjugate (Conjugado enzimático), 1
vial,14 mL, listo para usar; estradiol conjugado con la peroxidasa de rábano;
Contiene conservante sin mercurio. 5. Substrate Solution (Solución de
sustrato), 1 vial, 14 mL, listo para usar; Tetrametilbencidina (TMB). 6. Stop
Solution (Solución de parada), 1 vial, 14 mL, listo para usar; Contiene 0.5 M
H2SO4, Evitar el contacto con la Solución de parada. Puede causar irritación y
quemaduras en al piel. 7. Wash Solution (Solución de lavado), 1 vial, 30 mL
(concentrado 40X); Ver “Preparación de los Reactivos”.
4.2 Equipamiento y material requerido pero no provisto – Lector de microplacas
calibrado (450 nm, con longitud de onda de referencia a 620 nm a 630 nm) (ej.
DRG
Instruments Microtiter Plate Reader) – Micropipetas de precisión variable
calibradas – Papel absorbente – Agua destilada – Temporizador – Papel
cuadriculado o software para el cálculo de datos
4.3 Almacenamiento y estabilidad del kit Cuando se almacena a 2 °C a 8 °C, los
reactivos sin abrir mantienen su reactividad hasta la fecha de caducidad. No
utilizar los reactivos más allá de esta fecha. Los reactivos abiertos han de
almacenarse a 2 °C a 8 °C. Las placas multipocillo han de almacenarse a 2 °C a
8 °C. Una vez se ha abierto la bolsa hay que tener cuidado y cerrarla de
nuevo. Los kits abiertos conservan su actividad durante 8 semanas si se
almacenan como se ha descrito arriba.
4.4 Preparación de los Reactivos Dejar que todos los reactivos y el número
requerido de tiras alcancen la temperatura ambiente (20 °C a 26 °C) antes de
usarse.
Wash Solution Mezclar 30 mL de Wash Solution concentrada con 1170 mL de agua
destilada hasta un volumen final de 1200 mL. La solución del lavado diluida es
estable durante 1 semana a temperatura ambiente.
4.5 Eliminación del Kit El desecho del kit y de los materiales/reactivos
usados ha de realizarse conforme a la regulación nacional en vigor.
Información adicional sobre este producto se ofrece en las hojas de datos de
seguridad (Safety Data Sheet), sección 13).
4.6 Kits de ensayo dañados En caso de cualquier daño severo en el kit o en sus
componentes, DRG ha de ser informada por escrito una semana después de recibir
el kit como fecha límite. Componentes individuales que hayan sufrido daños
importantes no deberían usarse para realizar el test. Han de ser almacenados
hasta que se haya encontrado una solución final al problema. Después de
encontrarse una solución, pueden ser desechados en concordancia con las reglas
oficiales en vigor.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
5 MUESTRAS
En este ensayo se puede utilizar saliva. El muestreo debe realizarse por la
mañana antes de ingerir alimentos, beber o fumar. Se recomienda enjuagar bien
la boca con agua fría 5 minutos antes del muestreo. Si el muestreo debe
realizarse durante el día, se debe evitar comer, beber, fumar, masticar chicle
o cepillarse los dientes al menos 2 horas antes del muestreo. No recolecte
muestras cuando existan enfermedades, inflamación o lesiones bucales
(contaminación sanguínea). Nota: Las muestras que contienen azida de sodio no
deben usarse en el ensayo.
Consulte los capítulos ” Sustancias que pueden interferir” e ” Interferencias
con drogas”.
5.1 Recogida de la muestra Las muestras de saliva deben recogerse utilizando
SALI-TUBES 100 (REF SLV-4158, disponible en DRG). Otros dispositivos de
muestreo de saliva no se han probado y deben validarse bajo la responsabilidad
del usuario.
5.2 Almacenamiento y preparación de muestras
Muestras de saliva fresca Inmediatamente después de llegar al laboratorio, las
muestras de saliva fresca deben congelarse al menos durante la noche a -20 °C.
Cada muestra de saliva debe congelarse, descongelarse y centrifugarse para
separar las mucinas por centrifugación. Almacenamiento: inmediatamente a -20 °
C.
Luego, las muestras deben descongelarse y centrifugarse durante 5 a 10 minutos a 10 000 g. A partir de entonces, el sobrenadante transparente debe transferirse a un tubo nuevo. Solo este sobrenadante transparente se puede utilizar como muestra para el ELISA.
Si se debe analizar un conjunto de muestras múltiples, el laboratorio debe mezclar alícuotas del sobrenadante de 5 muestras individuales en un dispositivo de muestreo separado y realizar la prueba a partir de esta mezcla.
Sobrenadante Almacenamiento:
hasta 7 días entre 2 °C y 8 °C al menos 2 meses a -20 ° C, en alícuotas
El sobrenadante se debe congelar solo una vez. ¡El sobrenadante descongelado debe invertirse varias veces antes de la prueba!
5.3 Dilución de las muestras Si en un ensayo inicial, se encuentra una muestra que presenta valores mayores que el estándar mas concentrado, ha de diluirse con 0,9% NaCl y volver a ensayarse como se describe en el Procedimiento de Ensayo. Para el cálculo de las concentraciones habrá que tener en cuenta el factor de dilución.
Ejemplo: a) dilución 1:2: b) dilución 1:10:
50 µL muestra + 50 µL 0,9% NaCl (mezclar totalmente) 10 µL muestra + 90 µL 0,9% NaCl (mezclar totalmente)
6 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
6.1 Consideraciones generales
– Todos los reactivos y muestras han de estar a temperatura ambiente antes de
su uso. Todos los reactivos deben mezclarse sin formar espuma.
– Una vez se ha comenzado el ensayo deben completarse todos los pasos sin
interrupción. – Utilizar puntas de pipeta de plástico nuevas para cada
estándar, control o muestra para evitar combinaciones
cruzadas. – La densidad óptica es función del tiempo de incubación y la
temperatura. Antes de comenzar el ensayo, se recomienda
que todos los reactivos estén preparados, tapas removidas, todos los pocillos
que se necesiten asegurados en recipiente, etc. Esto asegurará un tiempo
similar para cada paso de pipeteo sin que haya interrupciones. – Como regla
general, la reacción enzimática es linealmente proporcional al tiempo y a la
temperatura.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
6.2 Procedimiento de ensayo Cada uno debe incluir una curva de estándares.
1. Asegurar el número deseado de pocillos en el recipiente. 2. Dispensar 100
µL de cada Standard, Control y muestras con puntas nuevas en los pocillos
adecuados. 3. Incubar durante 60 minutes a temperatura ambiente. 4. Dispensar
100 µL de Enzyme Conjugate a cada pocillo.
Mezclar totalmente durante 10 segundos. Es importante mezclar completamente en
este paso. 5. Incubar durante 60 minutes a temperatura ambiente. 6. Lavar los
pocillos 3 veces con 400 µL Wash Solution diluida por pocillo, si se utiliza
un lavador de placas.
– O Sacudir enérgicamente el contenido de los pocillos. Lavar los pocillos 3
veces con 300 µL Wash Solution diluida por pocillo para el lavado manual.
Realizar un golpe seco de los pocillos contra el papel absorbente para
eliminar las gotas residuales. Nota importante: La sensibilidad y la precisión
de este ensayo se ve marcadamente influenciada por la realización correcta del
proceso de lavado! 7. Adicionar 100 µL de Substrate Solution a cada pocillo.
8. Incubar durante 30 minutes a temperatura ambiente. 9. Parar la reacción
enzimática mediante la adición de 100 µL de Stop Solution a cada pocillo. 10.
Determinar la densidad óptica (DO) de la solución en cada pocillo a 450 nm
(lectura) y a 620 nm a 630 nm (se recomienda la sustracción de fondo) con un
lector de microplacas. Se recomienda que los pocillos se lean dentro de los 10
minutos siguientes a la adición de la solución de parada (Stop Solution).
6.3 Cálculo de los Resultados 1. Calcular los valores de densidad óptica (DO)
promedio para cada conjunto de estándares, controles y muestras de
pacientes. 2. Construir una curva estándar mediante la representación de la
densidad óptica media obtenida para cada estándar
frente a su concentración con el valor de DO en el eje vertical (Y) y la
concentración en el eje horizontal (X). 3. Usando el valor de la DO media de
cada muestra determinar la concentración correspondiente a partir de la curva
estándar. 4. Método automatizado: Los resultados en las instrucciones de uso
se han calculado automáticamente usando una
curva de regresión 4-Parámetros. (4-Parámetros Rodbard o 4-Parámetros
Marquardt son los métodos preferidos.) Otras funciones de regresión darán
lugar a resultados sensiblemente diferentes. 5. La concentración de las
muestras puede leerse directamente de la curva de estándares. Las muestras con
concentraciones superiores al mayor estándar han de diluirse. Para el cálculo
de las concentraciones hay que tener en cuenta el factor de dilución.
6.3.1 Ejemplo de una Curva Estándar Típica
Los siguientes datos son solamente para la explicación y no pueden ser utilizados en lugar de los datos generados en el momento del ensayo.
Estándar
Densidad óptica (450 nm)
Standard 0 (0 pg/mL)
1,99
Standard 1 (1 pg/mL)
1,80
Standard 2 (5 pg/mL)
1,45
Standard 3 (10 pg/mL)
1,20
Standard 4 (50 pg/mL)
0,48
Standard 5 (100 pg/mL)
0,24
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
7 VALORES ESPERADOS Se recomienda encarecidamente que cada laboratorio
determine sus valores normales e inusuales.
En un estudio llevado a cabo con individuos aparentemente sanos, usando el DRG
Salivary Estradiol HS ELISA, se obtuvieron los siguientes valores:
Población
n
Hombres
58
Mujeres
Premenopáusica
Fase folicular
26
Fase lútea
26
Posmenopáusica
26
Etapas del embarazo
1. trimestre
24
2. trimestre
24
3. trimestre
24
Media (pg/mL)
3,74
5,85 4,28 5,56
8,27 44,16 75,35
Mediana (pg/mL)
3,45
3,45 3,12 3,03
5,08 39,52 75,69
Percentil 2,5 – 97,5 (pg/mL)
1,26 9,12
Rango (min. – max.) (pg/mL)
0,74 11,46
1,32 29,35 1,46 14,97 1,21 28,43
2,33 25,29 7,29 97,68 23,25 126,49
1,08 46,42 1,19 22,94 1,02 41,48
1,90 28,98 7,20 97,86 21,38 149,68
Los resultados obtenidos no deberían ser el único motivo para una intervención terapéutica. Los resultados han de correlacionarse con otras observaciones clínicas y tests de diagnóstico.
8 CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda usar muestras control de acuerdo con las leyes estatales y
federales. El uso de muestras control se recomienda para asegurar la validez
diaria de los resultados. Usar controles tanto a niveles normal como
patológico. Los controles y los correspondientes resultados del Laboratorio de
control de calidad están fijados en el certificado de control de calidad que
acompañan al kit. Los valores y los rangos fijados en la hoja del control de
calidad se refieren siempre al kit actual y deben usarse para la comparación
directa de los resultados. Es recomendable también hacer uso de programas de
Aseguramiento de la Calidad nacionales o internacionales para asegurar la
exactitud de los resultados. Utilizar métodos estadísticos apropiados para el
análisis de los valores y tendencia de los controles. Si los resultados del
ensayo no se ajustan a los rangos aceptables establecidos en los controles,
los resultados obtenidos de los pacientes han de considerarse inválidos. En
este caso, por favor comprobar las siguientes áreas técnicas: Pipeteo y tiempo
empleado, fotómetro, fecha de caducidad de los reactivos, condiciones de
almacenamiento e incubación, métodos de aspiración y lavado. Después de
comprobar los asuntos arriba mencionado sin encontrar ningún error, contactar
con su distribuidor o con DRG directamente.
9 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO 9.1 Rango dinámico del ensayo El rango del ensayo
se encuentra entre 0,366 pg/mL 100 pg/mL.
9.2 Especificidad de los Anticuerpos (Reactividad Cruzada) Consultar el manual
de usuario en inglés.
9.3 Sensibilidad Analítica La sensibilidad analítica se calculó a partir de la
media menos dos veces la desviación estándar de veinte (20) réplicas del
Standard 0 y resultó ser 0,195 pg/mL.
El límite del blanco (LoB) es 0,145 pg/mL. El Límite de Detección (LoD) es
0,366 pg/mL. El Límite de Cuantificación (LoQ) es 0,736 pg/mL.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
Para información sobre 9.4 Precisión 9.5 Recuperación 9.6 Linealidad 9.7
Comparativa de métodos por favor consulte la versión detallada en inglés de
las Instrucciones de Uso.
10 LIMITACIONES DE USO Únicamente se obtendrán resultados fiables y
reproducibles, cuando el procedimiento del ensayo se realice entendiendo las
instrucciones de uso correctamente y desarrollando buenas prácticas de
laboratorio. Cualquier manejo impropio de las muestras o modificación del test
puede influenciar los resultados.
10.1 Sustancias que pueden interferir Las siguientes sustancias aumentarán los
valores de estradiol en más de un 20 %: café, etanol, café con leche, pasta de
dientes, cafeína, chicle, nicotina. Por el contrario, la hemoglobina reducirá
los valores de estradiol en más del 20 %.
10.2 Interferencias con drogas El Salivary Estradiol HS ELISA no debe usarse
en pacientes que estén siendo tratados con los medicamentos Fulvestrant
(Faslodex®) y Mifepristone (Mifegyne®), ya que esto podría conducir a
resultados falsamente elevados. Los pacientes que están en tratamiento con
L-tiroxina también pueden mostrar resultados de prueba falsamente elevados.
Para evitar interferencias con el tratamiento con dosis altas de L-tiroxina,
el muestreo debe realizarse directamente por la mañana antes de tomar
L-tiroxina o al menos 12 horas después de tomar L-tiroxina.
10.3 Efecto de Alta Concentración (Gancho) Un efecto de gancho de dosis alta
no se conoce para ensayos competitivos.
11 ASPECTOS LEGALES 11.1 Fiabilidad de los Resultados El ensayo debe
realizarse exactamente de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Mas aún,
el usuario debe ajustarse estrictamente a las reglas BPL (Buenas Prácticas de
Laboratorio) o a otros estándares y/o leyes nacionales aplicables. Esto es
especialmente relevante para el uso de reactivos control. Es importante
incluir siempre, dentro del procedimiento de ensayo, un número suficiente de
controles para validar la exactitud y la precisión del ensayo. Los resultados
del ensayo son válidos sólo si todos los controles se encuentran dentro de los
rangos especificados y si todos los otros parámetros del ensayo se encuentran
dentro de las especificaciones dadas para el ensayo. En cado de alguna duda o
inquietud, por favor, contactar con DRG.
11.2 Consecuencias Terapéuticas Las consecuencias terapéuticas nunca deben
basarse sólo en los resultados de laboratorio incluso si todos los resultados
del ensayo están de acuerdo con los asuntos fijados en el punto 11.1.
Cualquier resultado de laboratorio es solamente una parte del cuadro clínico
de un paciente. Solamente en los casos donde los resultados de laboratorio
están en acuerdo con todo el cuadro clínico de un paciente, se pueden derivar
consecuencias terapéuticas. Nunca deben derivarse consecuencias terapéuticas a
partir de solamente el resultado obtenido en el ensayo
11.3 Responsabilidad Cualquier modificación del kit y/o cambio o mezcla de
cualquier componente procedentes de kits de lotes diferentes puede afectar
negativamente a los resultados esperados y en la validez de todo el test. Esas
modificaciones y/o cambios invalidad cualquier reclamación de reposición. Las
reclamaciones emitidas debidas a una mala interpretación de los resultados de
laboratorio por parte del comprador referidos al punto 11.2 son también
inválidas. A pesar de todo, en el caso de cualquier reclamación, la
responsabilidad del fabricante no excede el valor del kit. Cualquier daño
provocado al kit durante su transporte no está sujeto a la responsabilidad del
fabricante.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
1 UTILISATION PRÉVUE
Français
Le kit de dosage immuno-enzymatique DRG Salivary Estradiol HS ELISA propose le
matériel requis pour la mesure quantitative de l’oestradiol libre actif, une
hormone stéroïde oestrogénique, dans la salive. Ce kit est à utiliser
uniquement dans le cadre de tests diagnostiques in vitro.
Les résultats peuvent être utilisés dans l’identification des troubles de la
fertilité chez la femme, pour diagnostiquer la ménopause et pour le contrôle
dans le cadre d’une thérapie hormonale.
2 PRINCIPE DU TEST
Le kit DRG Salivary Estradiol HS ELISA est un test immuno-enzymatique en phase
solide (ELISA basé sur le principe de liaison compétitive. Les puits de
microtitration sont recouverts d’un anticorps polyclonal dirigé contre les
sites antigéniques de la molécule d’oestradiol. Au cours de la incubation,
l’oestradiol présent dans l’échantillon ajouté entre en compétition avec le
conjugué enzymatique ajouté, qui est de l’oestradiol conjugué à la peroxydase
de raifort (HRP), pour se fixer à l’anticorps enrobé. Après une étape de
lavage pour éliminer toutes les substances non liées, la phase solide est
incubée avec la solution de substrat. La réaction colorimétrique est arrêtée
par l’ajout d’une solution d’arrêt, et la densité optique (DO) du produit
jaune résultant est mesurée. L’intensité de la couleur est inversement
proportionnelle à la concentration de l’analyte dans l’échantillon. Une courbe
standard est construite en traçant les valeurs de DO par rapport aux
concentrations des étalons, et les concentrations des échantillons inconnus
sont déterminées à l’aide de cette courbe standard.
3 AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS
– Ce kit est uniquement destiné aux tests diagnostiques in vitro. Pour un
usage professionnel seulement. – Utilisez uniquement la version valide
d´instructions d’utilisation qui est incluse dans le kit. – Les informations
concernant la toxicité des réactifs contenus dans ce kit sont présentées dans
la fiche de sécurité
(« Safety Data Sheets »). – Tous les réactifs de ce kit contenant du sérum ou
du plasma humain ont été testés avec des résultats négatifs pour le
VIH I/II, le HBsAg et le HCV selon les normes FDA en vigueur. Néanmoins, lors
de leur utilisation, tous les réactifs de ce kit doivent être manipulés avec
précaution. – Eviter les contacts avec la Stop Solution, celle-ci contient 0,5
M de H2SO4. Cela pourrait engendrer irritations ou brûlures de la peau. – Ne
jamais pipeter avec la bouche, et éviter tout contact de la peau ou des
muqueuses avec les réactifs ou les échantillons. – Ne pas fumer, manger, boire
ou utiliser des produits cosmétiques dans les zones où les échantillons ou le
kit ont été maniés.
– Porter des gants d’examen lors de l’utilisation des échantillons ou des
réactifs. Une contamination microbienne des échantillons ou des réactifs
pourrait fausser les résultats.
– L’utilisation de ce kit devra être en accord avec les normes ou
recommandations nationales de sécurité en vigueur concernant les produits à
risque biologique.
– Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date d’expiration inscrite sur
l’emballage. – Tous les volumes indiqués doivent être scrupuleusement
respectés, comme indiqué dans le protocole expérimental.
Seule l’utilisation de pipettes calibrées ou d’un spectrophotomètre lecteur de
microplaques calibré garantit l’obtention de résultats optimaux à ce test. –
Ne pas mélanger ou utiliser des réactifs contenus dans des kits de lots
différents. Il est conseillé de ne pas échanger les puits de différentes
plaques, même si celles-ci proviennent du même lot. Les kits peuvent avoir été
transportés ou stockés différemment, et les caractéristiques de liaison de
chaque plaque pourraient ainsi être modifiées.
– L’élimination des solutions chimiques et des réactifs contenus dans ce kit,
utilisés ou non, doit être en accord avec la réglementation nationale en
vigueur concernant l’élimination des déchets à risque biologique.
– La fiche de sécurité concernant ce produit peut être obtenue en contactant
directement DRG Instruments GmbH.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
4 RÉACTIFS 4.1 Réactifs fournis 1. Microtiterwells (Microplaques), 12 x 8 (à
détacher) barrettes, plaques de 96 puits;
Les puits sont recouverts avec un anticorps anti-oestradiol (polyclonal). 2.
Standard (Standard 0 – 5), 6 flacons, 1 mL chacun, prêts à l’emploi;
Concentrations: 0 1 5 10 50 100 pg/mL Les standards sont étalonnés
par rapport au matériel de référence suivante: Cerilliant E-060 Contient un
agent de conservation sans mercure. 3. Control Low & High (Contrôle), 2
flacons, 1 mL chacun, prêts à l’emploi; Pour les valeurs de contrôle et les
limites, se référer à l’étiquette du flacon ou au certificat d’analyse.
Contient un agent de conservation sans mercure. 4. Enzyme Conjugate (Conjugué
enzymatique), 1 flacon, 14 mL, prêt à l’emploi; Oestradiol conjugué à la HRP;
Contient un agent de conservation sans mercure. 5. Substrate Solution
(Solution substrat), 1 flacon, 14 mL, prêt à l’emploi; Tétraméthylbenzidine
(TMB). 6. Stop Solution (Solution d’arrêt), 1 flacon, 14 mL, prêt à l’emploi;
Contient 0,5 M de H2SO4, Eviter les contacts avec la solution stop. Cela
pourrait engendrer des irritations ou brûlures de la peau. 7. Wash Solution
(Solution de lavage), 1 flacon (concentré 40X); Voir « Préparation des
réactifs ».
4.2 Equipement et matériel requis, mais non fournis – Un spectrophotomètre
lecteur de microplaques calibré (450 nm, avec longueur d’onde de référence à
620 nm à
630 nm) (ex. le lecteur de microplaques de DRG Instruments GmbH) – Des micro-
pipettes de précision variables et calibrées – Du papier absorbant – De l’eau
distillée – Un minuteur – Papier graphique ou logiciel pour la réduction des
données
4.3 Stockage et stabilité du kit Les réactifs contenus dans des flacons non-
ouverts, stockés à 2 °C à 8 °C, seront stables jusqu’à la date d’expiration
inscrite sur l’étiquette. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de cette date.
Les réactifs contenus dans des flacons ouverts doivent être stockés à 2 °C à 8
°C. Les microplaques doivent être stockées à 2 °C à 8 °C. Une fois le sachet
en aluminium ouvert, attention à bien refermer le flacon. Les kits ouverts
conservent leur activité durant 8 semaines s’ils sont stockés comme
précédemment mentionné.
4.4 Préparation des réactifs Amener tous les réactifs et le nombre de
barrettes nécessaires au test à température ambiante (20 °C à 26 °C) avant
utilisation.
Wash Solution Pour le tampon de lavage (1x), diluer 30 mL de Wash Solution
(40x) dans 1170 mL d’eau distillée pour un volume final de 1200 mL. La
solution de lavage diluée est stable pendant 1 semaine à température ambiante.
4.5 Elimination du kit L’élimination du kit et de tout le matériel/tous les
réactifs doit être conforme aux réglementations nationales. Des informations
spécifiques au produit sont indiquées dans la fiche de données de sécurité,
rubrique 13.
4.6 Kits endommagés En cas de dommage du kit de tests ou de ses composants,
DRG doit en être informé par écrit, au plus tard une semaine après réception
du kit. Les composants endommagés ne doivent pas être utilisés pour le test.
Ils doivent être stockés jusqu’à ce qu’une solution adaptée ait été trouvée.
Après cela, ils doivent être éliminés conformément à la réglementation en
vigueur.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
5 PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES SPÉCIMENS
La salive peut être utilisée dans ce test. L’échantillonnage doit être
effectué le matin avant la prise de nourriture, boire ou fumer. Il est
recommandé de se rincer soigneusement la bouche à l’eau froide 5 minutes avant
le prélèvement. Si l’échantillonnage doit être fait pendant la journée, il
faut éviter de manger, de boire, de fumer, de mâcher des gommes ou de se
brosser les dents au moins 2 heures avant le prélèvement. Ne prélevez pas
d’échantillons en cas de maladie bucco-dentaire, d’inflammation ou de lésions
(contamination sanguine). Remarque: les échantillons contenant de l’azide de
sodium ne doivent pas être utilisés dans le test.
Veuillez-vous référer aux chapitres «Substances interférentes» et «Drogues
interférentes».
5.1 Prélèvement des spécimens Les échantillons de salive doivent être prélevés
à l’aide de SALI-TUBES 100 (REF SLV-4158, disponible auprès de DRG). Les
autres dispositifs de prélèvement de salive n’ont pas été testés et doivent
être validés sous la responsabilité de l’utilisateur.
5.2 Stockage et préparation des spécimens
Échantillons de salive fraîche
Immédiatement après leur arrivée au laboratoire, les échantillons de salive fraîche doivent être congelés au moins une nuit à -20 °C.
Chaque échantillon de salive doit être congelé, décongelé et centrifugé afin de séparer les mucines par centrifugation.
Stockage:
immédiatement à -20 °C
Ensuite, les échantillons doivent être décongelés et centrifugés pendant 5 à 10 minutes à 10 000 g. Ensuite, le surnageant clair doit être transféré dans un tube neuf. Seul ce surnageant clair peut être utilisé comme échantillon pour l’ELISA.
Si un ensemble d’échantillons multiples doit être testé, le laboratoire doit mélanger des aliquotes du surnageant de 5 échantillons individuels dans un dispositif d’échantillonnage séparé et effectuer les tests à partir de ce mélange.
Surnageant Conservation: jusqu’à 7 jours entre 2 °C et 8 °C
au moins 2 mois à -20 °C, en aliquotes
Le surnageant ne doit être congelé qu’une seule fois. Le surnageant décongelé
doit être inversé plusieurs fois avant le test!
5.3 Dilution de l’échantillon Si, lors d’un test préliminaire, la concentration de l’échantillon se révèle être supérieure à celle du standard le plus concentré, alors l’échantillon doit être dilué avec le 0,9% NaCl et testé de nouveau, comme décrit dans Réalisation du test. Pour le calcul des concentrations, ce facteur de dilution doit être pris en considération.
Exemple: a) dilution 1:2: b) dilution 1:10:
50 µL de l’échantillon + 50 µL 0,9% NaCl (bien mélanger). 10 µL de l’échantillon + 90 µL 0,9% NaCl (bien mélanger).
6 RÉALISATION DU TEST
6.1 Remarques générales
– Tous les réactifs et échantillons doivent être amenés à température ambiante
avant utilisation. Tous les réactifs doivent être mélangés, sans formation de
mousse.
– Une fois la procédure engagée, toutes les étapes doivent être réalisées sans
interruption. – Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque standard,
contrôle ou échantillon, ceci afin d’éviter toute
contamination. – La densité optique est fonction du temps d’incubation et de
la température. Avant de commencer le test, il est
recommandé de préparer tous les réactifs, bouchons ouverts, de préparer les
puits des microplaques, etc. Cela garantira un intervalle de temps équivalent
entre chaque étape, sans interruption. – En règle générale, la réaction
enzymatique est linéairement proportionnelle au temps et à la température.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
6.2 Réalisation du dosage Chaque test doit inclure une courbe étalon.
1. Disposer le nombre de puits de micro-titration désiré dans le support. 2.
Déposer 100 µL de chaque Standard, Control et les échantillons, avec de
nouveaux cônes de pipette, dans les
puits appropriés. 3. Incuber pendant 60 minutes à température ambiante. 4.
Déposer 100 µL d’Enzyme Conjugate dans chaque puits.
Bien mélanger pendant 10 secondes. Il est important d’obtenir un mélange
parfait lors de cette étape. 5. Incuber pendant 60 minutes à température
ambiante. 6. Rincer les puits 3 fois avec 400 µL de la Wash Solution diluée
par puits, si un laveur de microplaques est utilisé.
– OU Décanter le contenu des puits. Rincer les puits 3 fois avec 300 µL de la
Wash Solution diluée par puits pour un lavage manuel. Tapoter les puits sur du
papier absorbant afin d’éliminer les gouttelettes résiduelles. Remarque
importante: La sensibilité et la précision de ce test sont fortement
dépendantes de la bonne réalisation des étapes de lavage!
7. Ajouter 100 µL de Substrate Solution à chaque puits. 8. Incuber pendant 30
minutes à température ambiante. 9. Stopper la réaction enzymatique en ajoutant
100 µL de Stop Solution à chaque puits. 10. Déterminer la densité optique (DO)
de la solution dans chaque puits à 450 nm (lecture) et à 620 nm à 630 nm
(soustraction de fond, recommandée) à l’aide d’un spectrophotomètre lecteur de
microplaques. Il est recommandé de lire les puits dans les 10 minutes qui
suivent l’ajout de la solution d’arrêt (Stop Solution).
6.3 Calcul des résultats 1. Calculer les valeurs moyennes des densités
optiques (DO) pour chaque série de standards, contrôles et
échantillons. 2. Etablir la courbe étalon en reportant la densité optique
moyenne de chaque valeur standard en fonction de sa
concentration, en posant la densité optique en axe des ordonnées et la
concentration en axe des abscisses. 3. L’utilisation de la densité optique
moyenne pour chaque échantillon détermine la concentration correspondante à
partir de la courbe étalon. 4. Méthode automatique: Les résultats dans les
instructions d’utilisation ont été calculés de façon automatique en
utilisant une courbe de régression 4-Paramètres. (4-paramètres Rodbard ou
4-paramètres Marquardt sont les méthodes favorites.) D’autres fonctions
logistiques peuvent donner des résultats légèrement différents. 5. La
concentration des échantillons peut être lue directement à partir de cette
courbe étalon. Les échantillons avec une concentration supérieure à celle du
standard le plus concentré doivent être dilués de nouveau ou rapportés comme
étant > 100 pg/mL. Pour le calcul des concentrations, ce facteur de dilution
doit être pris en considération.
6.3.1 Exemple d’une courbe standard typique
Les résultats suivants sont ici présentés à titre d’exemple et ne peuvent être utilisés au moment de l’essai.
Standard
Densité optique (450 nm)
Standard 0 (0 pg/mL)
1,99
Standard 1 (1 pg/mL)
1,80
Standard 2 (5 pg/mL)
1,45
Standard 3 (10 pg/mL)
1,20
Standard 4 (50 pg/mL)
0,48
Standard 5 (100 pg/mL)
0,24
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
7 VALEURS NORMALES ATTENDUES Il est fortement recommandé à chaque laboratoire de déterminer ses propres valeurs normales et pathologiques.
Dans une étude menée sur des sujets apparemment sains, à l’aide du test Salivary Estradiol HS ELISA de DRG, les valeurs suivantes ont été observées :
Population
n
Valeur moyenne (pg/mL)
Médiane (pg/mL)
2,5. – 97,5. Percentile (pg/mL)
Portée (min. – max.) (pg/mL)
Hommes
58
3,74
3,45
1,26 9,12
0,74 11,46
Femmes
Préménopause
Phase folliculaire
26
5,85
3,45
1,32 29,35
1,08 46,42
Phase lutéale
26
4,28
3,12
1,46 14,97
1,19 22,94
Postménopausique 26
5,56
Les étapes de la
grossesse
3,03
1,21 28,43
1,02 41,48
1. Trimestre
24
8,27
5,08
2,33 25,29
1,90 28,98
2. Trimestre 3. Trimestre
24
44,16
24
75,35
39,52 75,69
7,29 97,68 23,25 126,49
7,20 97,86 21,38 149,68
Les résultats ne doivent pas être utilisés seuls pour déterminer les décisions thérapeutiques. Ils doivent être corrélés avec d’autres observations cliniques et tests diagnostiques.
8 CONTROLE DE QUALITE
Il est recommandé d’utiliser les échantillons contrôles selon les
réglementations nationales en vigueur. L’utilisation des échantillons
contrôles est recommandé afin de s’assurer jour après jour de la validité des
résultats. Utiliser les contrôles de valeurs normales et pathologiques. Les
contrôles et les résultats correspondants issus du laboratoire QC sont
mentionnés dans le certificat QC fourni avec le kit. Les valeurs et les
limites mentionnées sur la fiche QC font toujours référence au lot de kit
courant et doivent être utilisées pour une comparaison directe avec les
résultats.
Il est également recommandé d’utiliser les programmes d’évaluation de qualité
nationaux ou internationaux, afin de s’assurer de l’exactitude des résultats.
Utiliser les méthodes d’analyses statistiques appropriées pour l’analyse des
valeurs contrôles et des tendances. Si les résultats ne correspondent pas aux
limites établies des contrôles, les résultats concernant ces patients doivent
être considérées comme non valides. Dans ce cas, tester les zones techniques
suivantes : mécanisme de pipettage et temps; spectrophotomètre, dates
d’expiration des réactifs, conditions de stockage et d’incubation, méthodes
d’aspiration et de lavage. Après avoir tester les points mentionnés, si aucune
erreur n’est détectée, contacter votre distributeur ou directement la DRG.
9 CARACTERISTIQUES DES PERFORMANCES 9.1 Zone de mesure Les limites du dosage
sont comprises entre 0,366 pg/mL 100 pg/mL.
9.2 Spécificité des anticorps (réactivité croisée) Consulter la version
anglaise détaillée du mode d’emploi.
9.3 Sensibilité de l’analyse La sensibilité de l’analyse a été calculée en
soustrayant 2 écarts-types de la moyenne de l’analyse de 20 réplicats du
Standard 0 et a été mesurée à 0,195 pg/mL.
La limite du blanc (LoB) est de 0,145 pg/mL. La limite de détection (LoD) est
de 0,366 pg/mL. La limite de quantification (LoQ) est de 0,736 pg/mL.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
Pour obtenir des données concernant 9.4 Précision 9.5 Récupération 9.6
Linéarité 9.7 Comparaison des méthodes consulter la version anglaise détaillée
du mode d’emploi.
10 LIMITES D’UTILISATION Des résultats fiables et reproductibles seront
obtenus lorsque la procédure de test est effectuée avec une compréhension
complète de la notice et en respectant les bonnes pratiques de laboratoire.
Toute utilisation impropre des échantillons ou toute modification du test peut
influencer les résultats.
10.1 Substances interférentes Les substances suivantes augmenteront les
valeurs d’estradiol de plus de 20 %: café, éthanol, café au lait, dentifrice,
caféine, chewing-gum, nicotine. En revanche, l’hémoglobine diminuera les
valeurs d’estradiol de plus de 20 %.
10.2 Drogues interférentes Le test Salivary Estradiol HS ELISA ne doit pas
être utilisé chez les patients traités avec les médicaments Fulvestrant
(Faslodex®) et Mifepristone (Mifegyne®), car cela pourrait conduire à des
résultats faussement élevés. Les patients sous traitement par L-thyroxine
peuvent également présenter des résultats de test faussement élevés. Pour
éviter toute interférence avec le traitement à haute dose de L-thyroxine, le
prélèvement doit être effectué soit directement le matin avant de prendre
L-thyroxine, soit au moins 12 heures après la prise de L-thyroxine.
10.3 Effet de Hook Un effet de surdose (effet de crochet à forte dose) n’est
pas connu pour les tests compétitifs.
11 ASPECTS JURIDIQUES 11.1 Fiabilité des résultats Ce test doit être
exactement utilisé selon les instructions d’utilisation du fabricant. De plus,
les utilisateurs doivent strictement respecter les règles de la bonne pratique
de laboratoire, ou autres lois nationales. Cela est spécialement le cas pour
l’utilisation des réactifs contrôles. Pour chaque test, il est important
d’inclure un nombre suffisant de contrôles, afin de pouvoir valider
l’exactitude et la précision du test. Les résultats du test sont valides si et
seulement si tous les contrôles sont compris dans les gammes de mesure
mentionnées et si tous les autres paramètres du test sont également compris
dans les instructions de ce test. En cas de doute ou d’inquiétude, contacter
la DRG.
11.2 Conséquences thérapeutiques Les suites thérapeutiques ne devront jamais
être basées sur les résultats de laboratoire seuls, même si les tous les
résultats du test sont en accord avec les points mentionnés dans le paragraphe
11.1. Tout résultat n’est qu’une partie du tableau clinique complet d’un
patient. Les suites thérapeutiques peuvent découler des résultats de
laboratoire si et seulement si ceux-ci sont en accord avec l’ensemble du
tableau clinique du patient. Le résultat du test en lui-même ne doit en aucun
cas être le seul déterminant des suites thérapeutiques à suivre.
11.3 Responsabilité Toute modification du kit et / ou échange ou mélange d’un
des composants de différents lots, d’un kit à un autre, pourrait affecter de
façon négative les résultats attendus et la validité du test dans son
ensemble. De telles modifications ou échanges invalident toute réclamation
pour remplacement. Toutes les réclamations soumises, relatives au paragraphe
11.2, et dues à une mauvaise interprétation des résultats de laboratoire de la
part du client sont également invalides. Néanmoins, en cas de réclamation, la
responsabilité du fabricant n’est pas de dépasser les limites de la valeur du
kit. Tout dommage causé au kit lors de son transport n’est pas du ressort de
la responsabilité du fabricant.
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
12 REFERENCES / LITERATURE 1. Tsang BK et al. (1980) Steroid biosynthesis by
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1988, Ed.: Knobil et al., 975 988, Raven press, New York 4. Saldanha CJ,
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Salivary Estradiol HS ELISA SLV-6145
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Contenuto sufficiente per “n” saggi
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Contenido suficiente para
Data di scadenza
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Fabbricante
Fabricante
No. de lot Contenu suffisant pour “n” tests Température de conservation
Date limite d’utilisation
Fabricant
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Rischi biologici
Riesgos biológicos
Risques biologiques
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Solo a scopo di ricerca Distributore Contenuto Volume / Quantità
Sólo para uso en investigación Distribuidor Contenido Volumen / Número
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Microtiterwells Antiserum Enzyme Conjugate Enzyme Complex Substrate Solution Stop Solution Zero Standard Standard Control Assay Buffer Wash Solution
Microtiterwells Antiserum
Enzyme Conjugate
Enzyme Complex
Substrate Solution
Stop Solution Zero Standard Standard Control Assay Buffer Wash Solution
1N NaOH
1N NaOH
1 N HCl
1 N HCl
Sample Diluent Sample Diluent
Conjugate Diluent Conjugate Diluent
Mikrotiterwells Antiserum
Enzymkonjugat
Enzymkomplex
Substratlösung
Stopplösung Nullstandard Standard Kontrolle Assaypuffer Waschlösung 1N NaOH 1
N HCl Probenverdünnungsmedium Konjugatverdünnungsmedium
Micropozzetti Antisiero Tracciante enzimatico Complesso enzimatico Soluzione
di substrato Soluzione d´ arresto Standard zero Standard Controllo Tampone del
test Soluzione di lavaggio 1N NaOH (idrossido di sodio 1N)
Diluente dei campioni Diluente del tracciante
Placas multipocillo Antisuero
Microplaques Antisérum
Conjugado enzimático Conjugué enzymatique
Complejo enzimático
Complexe enzymatique
Solución de sustrato
Solution substrat
Solución de parada Estándar cero Estándar Control Tampón de ensayo Solución de
lavado
1N NaOH
1 N HCl Solución para dilución de la muestra Solución para dilución del
conjugado
Solution d’arrêt Zero Standard Standard Contrôle
Tampon d’essai Solution de lavage
1N NaOH
1N HCl Solution pour dilution de l’échantillon Solution pour dilution du
conjugué
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