illumina 550Dx Regulated for Molecular Diagnostics User Manual

: June 9, 2024
: illumina

Table of Contents

550Dx Regulated for Molecular Diagnostics
References
Read User Manual Online (PDF format)
Download This Manual (PDF format)

550Dx Regulated for Molecular Diagnostics

Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager
Workflowhandleiding voor NextSeq 550Dx

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Overzicht

3

Runinformatie invoeren

4

Analysemethoden

6

Run- en monstergegevens weergeven

7

Analysis Report (Analyserapport)

8

Uitvoerbestanden van analyse

9

Revisiegeschiedenis

16

Technische ondersteuning

17

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD Augustus 2021 BESTEMD VOOR IN- VITRODIAGNOSTIEK

BEDRIJFSEIGENDOM VAN ILLUMINA

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx
Dit document en de inhoud ervan zijn eigendom van Illumina, Inc. en haar dochterondernemingen (‘Illumina’), en zijn alleen bedoeld voor contractueel gebruik door haar klanten in verband met het gebruik van de hierin beschreven producten en voor geen enkel ander doel. Dit document en de inhoud ervan mogen niet worden gebruikt of gedistribueerd voor welk ander doel dan ook en/of op een andere manier worden gecommuniceerd, geopenbaard of gereproduceerd zonder de voorafgaande schriftelijke toestemming van Illumina. Illumina geeft door middel van dit document geen licenties onder haar patent, handelsmerk, auteursrecht of gewoonterechten noch soortgelijke rechten van derden door. De instructies in dit document moeten strikt en uitdrukkelijk worden opgevolgd door gekwalificeerd en voldoende opgeleid personeel om een correct en veilig gebruik van de hierin beschreven producten te waarborgen. Alle inhoud van dit document moet volledig worden gelezen en begrepen voordat dergelijke producten worden gebruikt. HET NIET VOLLEDIG LEZEN EN UITDRUKKELIJK OPVOLGEN VAN ALLE INSTRUCTIES IN DIT DOCUMENT KAN RESULTEREN IN SCHADE AAN DE PRODUCTEN, LETSEL AAN PERSONEN (INCLUSIEF GEBRUIKERS OF ANDEREN) EN SCHADE AAN ANDERE EIGENDOMMEN. BIJ HET NIET VOLLEDIG LEZEN EN UITDRUKKELIJK OPVOLGEN VAN ALLE INSTRUCTIES IN DIT DOCUMENT VERVALLEN ALLE GARANTIES DIE VAN TOEPASSING ZIJN OP HET PRODUCT. ILLUMINA IS OP GEEN ENKELE MANIER AANSPRAKELIJK VOOR GEVOLGEN VAN EEN ONJUIST GEBRUIK VAN DE PRODUCTEN DIE HIERIN WORDEN BESCHREVEN (INCLUSIEF DELEN DAARVAN OF SOFTWARE). © 2021 Illumina, Inc. Alle rechten voorbehouden. Alle handelsmerken zijn het eigendom van Illumina, Inc. of hun respectievelijke eigenaren. Ga naar www.illumina.com/company/legal.html voor meer informatie over specifieke handelsmerken.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

2

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx
Overzicht
De Germline Variant-module in Local Run Manager is bedoeld voor gebruik met de Illumina TruSeq Custom Amplicon Kit Dx assay en de NextSeq 550Dx. Indien gebruikt met de Germline Variant-module, is de test bedoeld voor het voorbereiden van bibliotheken die worden gebruikt voor sequencing van DNA uit perifere volbloedmonsters. De analysemodule controleert korte regio’s van geamplificeerd DNA, of amplicons, op varianten. Door gerichte sequencing van amplicons is een hoge dekking van bepaalde gebieden mogelijk. Raadpleeg de bijsluiter TruSeq Custom Amplicon Kit Dx (documentnr. 1000000029772). De Germline Variant-analysemodule vereist verbruiksgoederen voor sequencing van 300 cycli. Raadpleeg voor meer informatie de bijsluiter NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 of NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5.
Toelichting op deze handleiding
In deze handleiding vindt u instructies voor het instellen van runparameters voor sequencing en analyse voor de Germline Variant-analysemodule. Zie de NextSeq 550Dx-instrumenthandleiding (documentnr. 1000000009513) voor meer informatie over het dashboard en de systeeminstellingen van Local Run Manager.
Local Run Manager weergeven
De interface van Local Run Manager kan worden weergegeven in NextSeq 550Dx Operating Software (NOS) of met een webbrowser. De ondersteunde webbrowser is Chromium.
OPMERKING Als u een niet-ondersteunde browser gebruikt, moet u de ondersteunde browser downloaden wanneer dat wordt gevraagd bij het bericht ‘Confirm Unsupported Browser’ (Niet-ondersteunde browser bevestigen). Selecteer hier om de ondersteunde versie van Chromium te downloaden.
Weergeven op de instrumentmonitor
1 Als u de interface van Local Run Manager op de instrumentmonitor wilt weergeven, selecteert u een van de volgende opties: u Selecteer op de NOS- startpagina de optie Local Run Manager. Klik op de X in de rechterbovenhoek om terug te keren naar NOS wanneer u klaar bent. u Selecteer het pictogram NOS minimaliseren, open de Chromium-webbrowser die op het instrument staat en voer http://localhost in de adresbalk in. Alleen admin users (beheerders) kunnen NOS minimaliseren.
Weergeven vanaf een netwerkcomputer
1 Open een Chromium-webbrowser op een computer met toegang tot hetzelfde netwerk als het instrument en maak verbinding met behulp van het IP-adres of de naam van het instrument. Bijvoorbeeld: http://myinstrument.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

3

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Runinformatie invoeren
Parameters instellen
1 Log in bij Local Run Manager.
2 Selecteer Create Run (Run aanmaken) en selecteer Germline Variant (Kiemlijn- variant).
3 Voer een runnaam in die de run van de sequencing tot en met de analyse identificeert. Gebruik alfanumerieke tekens, spaties, onderstrepingstekens of streepjes.
4 [Optioneel] Voer een runbeschrijving in om de run te kunnen identificeren. Gebruik alfanumerieke tekens, spaties, onderstrepingstekens of streepjes.
5 Selecteer het aantal monsters en de indexset in de vervolgkeuzelijst. Overweeg de volgende informatie wanneer u een keuze maakt.
u De vervolgkeuzelijst bevat hoeveelheden van monsters met een indexset. Bijvoorbeeld: 24-Set 1 geeft aan dat er 24 monsters moeten worden getest, met indexen uit Indexset 1.
u De nummers van de indexsets verwijzen naar verschillende sets met i5-indexen. Set 1 en set 2 bieden allebei indexdiversiteit. Er worden twee indexsets aangeboden om uitputting van een enkele set te voorkomen.
u Kies het aantal monsters dat het dichtst ligt bij het aantal monsters dat u gaat testen. Als het exacte aantal monsters niet in de lijst staat, selecteert u het aantal dat het dichtst bij is, maar minder dan het aantal dat u gaat testen. Als u bijvoorbeeld 18 monsters wilt testen, selecteert u 16 monsters.
u Monsterputjes en indexcombinaties die aan de eisen voor indexdiversiteit voldoen, zijn groen gemarkeerd. Als u andere putjes en indexcombinaties selecteert, krijgt u bij het opslaan van de run een melding als niet aan de vereisten voor indexdiversiteit is voldaan.
Manifestbestanden voor de run importeren
1 Zorg ervoor dat de manifesten die u wilt importeren beschikbaar zijn op een toegankelijke netwerklocatie of op een USB-stick.
2 Selecteer Import Manifests (Manifesten importeren).
3 Blader naar het manifestbestand en selecteer de manifesten die u wilt toevoegen.
OPMERKING Als u manifestbestanden beschikbaar wilt maken voor alle runs die de Germline Variant-analysemodule gebruiken, voegt u manifesten toe via de module-instellingen. Voor deze functie zijn machtigingen op beheerdersniveau vereist. Raadpleeg voor meer informatie de NextSeq 550Dx-instrumenthandleiding (documentnr. 1000000009513).
Monsters voor de run specificeren
Geef monsters op voor de run via een van de opties en de bijbehorende instructies. u Enter samples manually (Monsters handmatig invoeren): gebruik de lege tabel in het scherm ‘Create Run’
(Run aanmaken). u Import samples (Monsters importeren): navigeer naar een extern bestand met een kommagescheiden
(*.csv) indeling. In het scherm ‘Create Run’ (Run aanmaken) kan een sjabloon worden gedownload.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

4

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx
Nadat u de monstertabel hebt gevuld, kunt u de monsterinformatie naar een extern bestand exporteren. Gebruik het bestand als referentie wanneer u bibliotheken voorbereidt of importeer het bestand voor een andere run.
Monsters handmatig invoeren
1 Voer in het veld Sample ID (Monster-ID) een unieke identificatie voor het monster in. Gebruik alfanumerieke tekens, streepjes of onderstrepingstekens.
2 [Optioneel] Klik voor positieve of negatieve controlemonsters met de rechtermuisknop en selecteer het controletype.
3 [Optioneel] Voer een monsteromschrijving in het veld Sample Description (Monsterbeschrijving) in. Gebruik alfanumerieke tekens, streepjes of onderstrepingstekens. Monsteromschrijvingen zijn gekoppeld aan een monsternaam. Monsteromschrijvingen worden overschreven als dezelfde monsternaam in een latere run opnieuw wordt gebruikt.
4 Selecteer een Index 1-adapter uit de vervolgkeuzelijst Index 1 (i7). Wanneer u voorgestelde monsterputjes gebruikt, vult de software automatisch i7- en i5-indexadapters in die voldoen aan de vereisten voor indexdiversiteit. Als het exacte aantal monsters dat u wilt testen niet in de lijst staat, moet u indexadapters voor extra putjes selecteren. Als u indexen moet kiezen voor extra putjes of als u niet de aanbevolen combinaties van indexadapters gebruikt, moet u, voordat u indexen kiest, eerst Basebepaling en indexdiversiteit op pagina 15.
5 Selecteer een Index 2-adapter uit de vervolgkeuzelijst Index 2 (i5).
6 Selecteer een manifestbestand in de vervolgkeuzelijst Manifest.
7 Kies een optie om de plaatindeling te bekijken, af te drukken of op te slaan als referentie voor het prepareren van bibliotheken: u Selecteer het pictogram Print (Afdrukken) om de indeling van de plaat weer te geven. Selecteer Print (Afdrukken) om de plaatindeling af te drukken. u Selecteer Export (Exporteren) om monsterinformatie naar een extern bestand te exporteren. Controleer of de gegevens van het manifest en de monsters correct zijn. Onjuiste informatie kan de resultaten beïnvloeden.
8 Selecteer Save Run (Run opslaan).
Monsters importeren
1 Selecteer Import Samples (Monsters importeren) en blader naar de locatie van het monsterinformatiebestand. U kunt twee soorten bestanden importeren. u Selecteer Template (Sjabloon) in het scherm ‘Create Run’ (Run aanmaken) om een nieuwe plaatindeling te maken. Het sjabloonbestand bevat de juiste kolomkoppen voor importeren. Voer in elke kolom monsterinformatie in voor de monsters in de run. Verwijder voorbeeldinformatie in ongebruikte cellen en sla het bestand op. u Gebruik een bestand met monsterinformatie dat is geëxporteerd uit de Germline Variant-module met de exporteerfunctie.
2 Selecteer het pictogram Print (Afdrukken) om de indeling van de plaat weer te geven.
3 Selecteer Print (Afdrukken) om de indeling van de plaat af te drukken als referentie voor het voorbereiden van bibliotheken.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

5

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx
4 [Optioneel] Selecteer Export (Exporteren) om monsterinformatie naar een extern bestand te exporteren. Controleer of de gegevens van het manifest en de monsters correct zijn. Onjuiste informatie kan de resultaten beïnvloeden.
5 Selecteer Save Run (Run opslaan).
Een run bewerken
Raadpleeg voor instructies voor het bewerken van de informatie in uw run voordat u een sequencing start de NextSeq 550Dx-instrumenthandleiding (documentnr. 1000000009513).
Analysemethoden
De Germline Variant-analysemodule voert de volgende analysestappen uit en schrijft de uitvoerbestanden van de analyse naar de map Alignment. u Voert demultiplexen van indexbepalingen uit u Genereert FASTQ-bestanden u Lijnt uit op een referentie u Identificeert varianten
Demultiplexen
Met demultiplexen wordt elke indexbepalingssequentie met de voor de run opgegeven indexsequenties vergeleken. In deze stap worden geen kwaliteitswaarden overgenomen. Indexbepalingen worden geïdentificeerd aan de hand van de volgende stappen: u De monsternummering begint bij 1 in de volgorde waarin ze in de run zijn opgenomen. u Monsternummer 0 is gereserveerd voor clusters die niet aan een monster zijn toegewezen. u Clusters worden toegewezen aan een monster wanneer de indexsequentie exact overeenkomt of
wanneer er maximaal één discrepantie per indexbepaling is.
FASTQ-bestand genereren
Na het demultiplexen genereert de software tussenliggende analysebestanden in de FASTQbestandsindeling, wat een tekstindeling is die wordt gebruikt om sequenties weer te geven. FASTQbestanden bevatten bepalingen voor elk monster en de bijbehorende kwaliteitsscores. Clusters die niet door het filter zijn gekomen, worden uitgesloten. Elk FASTQ-bestand bevat bepalingen van slechts één monster. De naam van dat monster is opgenomen in de FASTQ-bestandsnaam. FASTQ-bestanden zijn de primaire invoer voor uitlijning. Per monster worden er acht FASTQ-bestanden gegenereerd : vier uit Bepaling 1 en vier uit Bepaling 2.
Uitlijning
Tijdens de uitlijningsstap lijnt het gebandeerde Smith-Waterman-algoritme clusters van elk monster uit met amplicon-sequenties die in het manifestbestand zijn opgegeven. Het gebandeerde Smith-Waterman-algoritme voert semiglobale sequentie-uitlijningen uit om gelijksoortige gebieden tussen twee sequenties te bepalen. In plaats van de totale sequentie te vergelijken, vergelijkt het Smith-Waterman-algoritme segmenten van alle mogelijke lengtes.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

6

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Elke paired-end-bepaling wordt geëvalueerd wat betreft uitlijning met de relevante probesequenties voor die bepaling. u Bepaling 1 wordt geëvalueerd aan de hand van de omgekeerde aanvulling van de Downstream Locus-
Specific Oligos (DLSO). u Bepaling 2 wordt geëvalueerd aan de hand van de Upstream Locus-Specific Oligos (ULSO). u Indien het begin van een afgelezen waarde overeenkomt met een probesequentie en niet meer dan drie
verschillen bevat (discrepanties of verschuivingen door leidende indels), wordt de volledige lengte van de afgelezen waarde uitgelijnd met het amplicondoel voor die sequentie. u Gegeven de chemie van de assay worden indels binnen de DLSO en ULSO niet waargenomen. Uitlijningen worden uit uitlijningsresultaten gefilterd op basis van discrepantiepercentages over ofwel het gebied van belang ofwel het volledige amplicon, afhankelijk van de lengte van het amplicon. Gefilterde uitlijningen worden in uitlijningsbestanden weggeschreven als niet-uitgelijnd en worden niet gebruikt bij het aanroepen van varianten.
Variantbepaling
De Pisces-variantbepaler, die is ontwikkeld door Illumina, identificeert varianten die in het DNA-monster voorkomen. De Pisces-variantbepaler identificeert SNV’s, MNV’s en kleine indels in drie stappen: u Overweegt elke positie in het referentiegenoom afzonderlijk u Telt basen op de gegeven positie voor uitgelijnde bepalingen die de positie overlappen u Berekent een variantscore die de kwaliteit van de bepaling meet met behulp van het Poisson- model.
Varianten met een kwaliteitsscore lager dan Q20 worden uitgesloten. Als een variant door alle filters heenkomt, wordt de variant gemarkeerd as PASS (Geslaagd) in VCF. Zie github.com/Illumina/Pisces/wiki voor meer informatie.
Run- en monstergegevens weergeven
1 Klik in het dashboard van Local Run Manager op de runnaam.
2 Bekijk op het tabblad Run Overview (Runoverzicht) de metrische gegevens van de sequencing-run.
3 [Optioneel] Klik op het pictogram Copy to Clipboard (Naar klembord kopiëren) om het pad naar de uitvoermap voor de run te kopiëren.
4 Klik op het tabblad Sequencing Information (Sequencinginformatie) om de runparameters en de informatie over de verbruiksartikelen te bekijken.
5 Klik op het tabblad Samples and Results (Monsters en resultaten) om de locatie van het analyserapport weer te geven. u Als de analyse is herhaald, opent u het vervolgkeuzemenu Select Analysis (Analyse selecteren) en selecteert u de juiste analyse.
6 Klik op het pictogram Copy to Clipboard (Naar klembord kopiëren) om het pad naar de analysemap te kopiëren.
Raadpleeg voor meer informatie over de tabbladen Run Overview (Runoverzicht) en Sequencing Information (Sequencinginformatie), en hoe u een analyse opnieuw kunt uitvoeren, de NextSeq 550Dxinstrumenthandleiding (documentnr. 1000000009513).

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

7

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Analysis Report (Analyserapport)
De analyseresultaten staan in een samenvatting op het tabblad Samples and Results (Monsters en resultaten) en in een samenvattend rapport in de map Alignment (Uitlijning). Voor elk monster is ook een rapport in PDF-indeling beschikbaar.

Informatie op het tabblad Samples and Results (Monsters en resultaten)

1 Klik op een monster in de lijst om het monsterrapport te openen.

Tabel 1 Informatie over run en monster

Kol omk op

Omschrijving

Run Status (Runstatus)

Geeft aan of de sequencing-run geslaagd of mislukt is.

Total Yield (GB) (Totaal resultaat (GB))

Aantal basen die in de sequencing-run zijn bepaald. Toont de drempelwaarde en de status geslaagd of mislukt.

% Q30

Het percentage bepalingen in de sequencing-run met een kwaliteitsscore van 30 (Q30) of hoger. Toont de drempelwaarde en de status geslaagd of mislukt.

Sample ID (Monster-ID)
Total PF Reads (Totaal PFbepalingen)
Read 1% Q30 (Bepaling 1% Q30)
Read 2% Q30 (Bepaling 2% Q30)
Autosome Call Rate (Bepalingspercentage van autosomen)

De monster-ID die bij het aanmaken van de run is opgegeven.
Het totale aantal bepalingen dat door het filter komt.
Het percentage bepalingen in Bepaling 1 met een kwaliteitsscore van 30 (Q30) of hoger voor het monster.
Het percentage bepalingen in Bepaling 2 met een kwaliteitsscore van 30 (Q30) of hoger voor het monster.
Het aantal genomische posities in de autosomen (chromosomen 1 tot en met 22) dat aan een vooraf bepaalde drempelwaarde voor de betrouwbaarheidsgraad voldoet, gedeeld door het totale aantal onderzochte autosomale genomische posities. Het bepalingspercentage wordt per monster beschreven en gerapporteerd als 1 min (het aantal autosomale posities met onvolledige bepalingen gedeeld door het totale aantal autosomale posities waarvan de sequentie is bepaald).

Tabel 2 Informatie in monsterrapport

Kol omk op

Omschrijving

Monster

De monster-ID die bij het aanmaken van de run is opgegeven.

Report Date (Rapportdatum)

Datum waarop het rapport werd gegenereerd.

Sample Information ( M on ste rin f orm a tie )

De monster-ID die werd opgegeven bij het aanmaken van de run, het totaal aantal bepalingen die door de filter in het monster zijn gekomen, het bepalingspercentage voor het monster met een kwaliteitsscore van 30 (Q30) of hoger en het autosomale be pa lin gspe rc e n ta ge .

Amplicon Summary (Ampliconsamenvatting)

Totaal aantal gesequencete amplicongebieden en de totale lengte in basenparen van gesequencete amplicons in de doelgebieden, voor het monster en het manifestbestand. Het manifestbestand specificeert het referentiegenoom en de doelreferentiegebieden die in de uitlijningsstap worden gebruikt.

Read Level Statistics (Statistieken Aantal en percentage van bepalingen voor het monster die elke positie in de

van bepalingsniveaus)

referentie dekken voor Bepaling 1 en Bepaling 2.

Variants Summary (Overzicht van va ria n te n )

Aantal gedetecteerde SNV’s, invoegingen en verwijderingen voor het monster dat voldoet aan de voorgestelde waarden om te bepalen of de kwaliteitsresultaten binnen een aanvaardbaar bereik liggen.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

8

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Kol omk op Coverage Summary ( De kkin gssa m e n va ttin g)
Coverage Plots ( De kkin gsdia gra m m e n )
Software Versions ( S of tw a re ve rsie s)

Omschrijving
Het totale aantal uitgelijnde basen gedeeld door de grootte van het doelgebied en het percentage amplicongebieden met dekkingswaarden die groter zijn dan de lage dekkingsdrempel van 0,2 * amplicon gemiddelde dekking voor het monster.
De grafiek Coverage by Amplicon Region (Dekking per amplicongebied) toont de dekking binnen de amplicongebieden voor het monster. Gebieden met dekkingswaarden die lager zijn dan de dekkingsdrempel, zijn rood gemarkeerd. Het gemiddelde van alle waarden wordt aangegeven door een oranje lijn.
Softwareversies toen het monster werd gesequencet. Omvat de NextSeq 550Dx Operating Software (NOS), de Local Run Manager-software, de RTA-software en de Germline Variant-moduleversie.

Uitvoerbestanden van analyse
De volgende uitvoerbestanden van de analyse worden gegenereerd voor de Germline Variant-analysemodule en bevatten analyseresultaten voor uitlijning en bepaling van varianten. De uitvoerbestanden van de analyse bevinden zich in de map Alignment.

Bestandsnaam Demultiplexen (.txt) FASTQ (.fastq.gz)
Uitlijningsbestanden in de BAMbestandsindeling (.bam) Variantbepalingsbestanden met genome VCF-indeling (.genome.v cf.gz) Variantbepalingsbestanden met VCF-bestandsindeling (*.vcf.gz) Amp l i conC ov er age_M1.t s v

Omschrijving Tussenliggende bestanden met samenvattende demultiplexresultaten. Tussenliggende bestanden die basepalingen met kwaliteitsscores bevatten. FASTQ-bestanden zijn de primaire invoer voor de uitlijningsstap. Bevat uitgelijnde bepalingen voor een bepaald monster.
Bevat het genotype voor elke positie, of het nu als variant of als referentie wordt aangeroepen.
Bevat alle bepaalde varianten in de doelregio.
Bevat informatie over de dekking per amplicon en per monster voor elk verstrekt manifest. M# staat voor het manifestnummer.

Bestandsindeling voor demultiplexen
Bij demultiplexen wordt de aan elk cluster gekoppelde indexsequentie gelezen om te bepalen van welk monster het cluster afkomstig is. De toewijzing van clusters aan monsternummers wordt weggeschreven naar een demultiplexbestand (*.demux) voor elke tegel van de stroomcel. De naamgeving van het demultiplexbestand is s_1_X.demux, waarbij X het nummer van de tegel is. Demultiplexbestanden beginnen met een kopregel: u Versie (geheel getal van 4 bytes), momenteel 1 u Clustertelling (geheel getal van 4 bytes) De rest van het bestand bestaat uit monsternummers voor elk cluster uit de tegel. Wanneer het demultiplexen is voltooid, genereert de software een demultiplexbestand met de naam DemultiplexSummaryF1L1.txt. u In de bestandsnaam staat F1 voor het stroomcelnummer. u In de bestandsnaam staat L1 voor het baannummer. u Demultiplexen resulteert in een tabel met 1 rij per tegel en 1 kolom per monster, inclusief monster 0.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

9

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx
u De meest voorkomende sequenties in indexbepalingen.
FASTQ-bestandsindeling
FASTQ is een tekstbestandsindeling die basepalingen en kwaliteitswaarden per bepaling bevat. Elke record bevat 4 regels: u De identificatie u De sequentie u Een plusteken (+) u De Phred-kwaliteitsscores in een ASCII + 33-indeling De identifier is als volgt ingedeeld: @Instrument:RunID:FlowCellID:Lane:Tile:X:Y ReadNum:FilterFlag:0:SampleNumber Voorbeeld:
@SIM:1:FCX:1:15:6329:1045 1:N:0:2 TCGCACTCAACGCCCTGCATATGACAAGACAGAATC +

<>;##=><9=AAAAAAAAAA9#:<#<;<<Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

10

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

VCF-bestandsindeling
Variant Call Format (VCF) is een veelgebruikte bestandsindeling die is ontwikkeld door de wetenschappelijke genomicagemeenschap. VCF-bestanden bevatten informatie over varianten die op specifieke posities in een referentiegenoom worden aangetroffen. VCF-bestanden eindigen op het achtervoegsel .vcf
De kopregel van het VCF-bestand bevat de versie van de VCF-bestandsindeling en de versie van de variantbepaler en vermeldt de annotaties die in de rest van het bestand worden gebruikt. De VCF-kopregel vermeldt ook het referentiegenoombestand en het BAM-bestand. De laatste regel in de kopregel bevat de kolomtitels voor de gegevensregels. Alle gegevensregels van het VCF- bestand bevatten informatie over één variant.
VC-bestandskopregels

Kop r egel CHROM POS ID
REF ALT
QUAL

Omschrijving
Het chromosoom van het referentiegenoom. Chromosomen verschijnen in dezelfde volgorde als het FASTQ-referentiebestand.
De enkele basepositie van de variant in het referentiechromosoom. Voor SNP’s is deze positie de referentiebasis met de variant. Voor indels of verwijderingen is deze positie de referentiebasis onmiddellijk vóór de variant.
Het rs-nummer voor de variant verkregen uit dbSNP.txt, indien van toepassing. Als er meerdere rs-nummers op deze locatie staan, worden ze in de lijst door puntkomma’s gescheiden. Als op deze positie geen dbSNP-gegeven bestaat, wordt een markering voor ontbrekende waarde (‘.’) ge bru ikt.
Het referentiegenotype. Zo wordt een verwijdering van één T weergegeven als referentie-TT en alternatieve T. Een A-naar-T-variant van één nucleotide wordt weergegeven als referentie A en alternatieve T.
De allelen die verschillen van de referentiebepaling. Bijvoorbeeld, een invoeging van een enkele T wordt weergegeven als referentie A en alternatieve AT. Een A-naar-T-variant van één nucleotide wordt weergegeven als referentie A en alternatieve T.
Een kwaliteitsscore op de Phred-schaal die is toegekend door de variantbepaler. Hogere scores wijzen op een groter vertrouwen in de variant en een lagere score op de waarschijnlijkheid van aanwezige fouten. Voor een kwaliteitsscore van Q is de geschatte kans op een fout 10-(Q/10). De reeks Q30-bepalingen heeft bijvoorbeeld een foutenpercentage van 0,1%. Veel variantbepalers kennen kwaliteitsscores toe op basis van hun statistische modellen, die hoog zijn in verhouding tot het waargenomen foutenpercentage.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

11

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

VCF-bestandsannotaties

Kop r egel FILTER (Filter) INFO (Informatie)
FORMAT (Indeling)
SAMPLE (Monster)

Omschrijving
Als aan alle filters is voldaan, wordt PASS in de filterkolom geschreven. · LowDP: Toegepast op locaties met een dekkingsdiepte van minder dan 150 x. Voor
ampliconposities die zowel door de voorwaartse als door de achterwaartse bepaling worden gedekt, komt dit overeen met een dekking van 300 paired-end- bepalingen. · q20: Kwaliteitsscore < 20. · MultiAllelicSite–Variant voldoet niet aan het diploïde model. · R5x9: Het aantal aangrenzende herhalingen (van lengte 1 tot 5 bp) op de variantbepalingen 9. · SB: De systematische fout van de streng is groter dan de bepaalde drempel.
Mogelijke vermeldingen in de kolom INFO zijn: · AC: Aantal allelen in genotypen voor elk ALT-allel, in dezelfde volgorde als vermeld. · AF: Allelfrequentie voor elk ALT-allel, in dezelfde volgorde als vermeld. · AN: Het totale aantal allelen in de genoemde genotypen. · CD: Een vlag die aangeeft dat de SNP voorkomt in het coderende gebied van ten minste 1
Re f G e n e -ve rm e ldin g. · DP: De diepte (aantal basepalingen uitgelijnd op een positie en gebruikt bij het bepalen van
va ria n te n ) . · Exon: Een door komma’s gescheiden lijst van exongebieden die uit RefGene zijn gelezen. · FC: Functioneel gevolg. · GI: Een door komma’s gescheiden lijst van gen-ID’s die uit RefGene zijn gelezen. · QD: Variantvertrouwen/kwaliteit per diepte. · TI: Een door komma’s gescheiden lijst van transcript-ID’s die uit RefGene zijn gelezen.
In de indelingskolom staan de velden gescheiden door dubbele punten. Bijvoorbeeld: GT:GQ. De lijst van verstrekte velden hangt af van de gebruikte variantbepaler. Beschikbare velden zijn: · AD: Invoer van de vorm X, Y, waarbij X het aantal referentiebepalingen is en Y het aantal
alternatieve bepalingen. · DP: Geschatte bepalingsdiepte; bepalingen met MQ=255 of met slechte paren worden
ge f ilte rd. · GQ: Kwaliteit van het genotype. · GT: Genotype. 0 komt overeen met de referentiebase, 1 komt overeen met de eerste
vermelding in de kolom ALT, enz. De schuine streep (/) geeft aan dat er geen faseringsinformatie beschikbaar is. · NC: Fractie van basen die niet zijn bepaald, of met een basebepalingskwaliteit beneden de m in im u m dre m pe l. · NL: Ruisniveau; een schatting van de basebepalingsruis op deze positie. · SB: Systematische fout van streng op deze positie. Grotere negatieve waarden wijzen op minder systematische fouten. Waarden dicht bij 0 wijzen op meer systematische fouten. · VF: Variantfrequentie; het bepalingspercentage dat het alternatieve allel ondersteunt.
In de kolom Sample (Monster) staan de waarden die in de kolom FORMAT (Indeling) zijn opgegeven.

Genome VCF-bestanden
Genome VCF-bestanden (gVCF) zijn VCF v4.1-bestanden die een reeks conventies volgen om alle locaties binnen het genoom in een redelijk compact formaat weer te geven. De gVCF-bestanden (*.genome.vcf.gz) bevatten alle locaties binnen de betrokken regio in één bestand voor elk monster.
Het gVCF-bestand toont niet-bepalingen op posities die niet door alle filters komen. De genotypetag (GT) ./. geeft een niet-bepaling aan.
Zie voor meer informatie sites.google.com/site/gvcftools/home/about-gvcf.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

12

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Bestand met amplicon-dekking
Voor elk manifestbestand wordt een bestand met amplicon-dekking gegenereerd. Het M-nummer in de bestandsnaam staat voor het manifestnummer.
Elk bestand bevat een kopregelrij met de monster-ID’s die bij het manifest horen. Het bestand bevat de volgende informatie.
u De doel-ID zoals die in het manifest staat vermeld.
u De dekkingsdiepte van bepalingen die door het filter komen.
Aanvullende uitvoerbestanden
De volgende uitvoerbestanden bevatten aanvullende informatie of een samenvatting van de runresultaten en analysefouten. Hoewel deze bestanden niet nodig zijn voor de beoordeling van de analyseresultaten, kunnen ze worden gebruikt voor het oplossen van problemen. Alle bestanden bevinden zich in de map Alignment, tenzij anders aangegeven.

Bestandsnaam Anal y s i s Log.t x t Anal y s i s E r r or .t x t D emul t i p l ex S ummar y F1L1#.t x t Amp l i conR unS t at i s t i cs .x ml

Omschrijving
Verwerkingslogboek waarin elke stap wordt beschreven die is uitgevoerd tijdens de analyse van de huidige runmap. Dit bestand bevat geen foutmeldingen. Bevindt zich in de map Alignment.
Verwerkingslogboek waarin een lijst is opgenomen van eventuele fouten die tijdens de analyse zijn opgetreden. Dit bestand is leeg als er geen fouten zijn opgetreden. Bevindt zich in de map Alignment.
Rapporteert demultiplexresultaten in een tabel met 1 rij per tegel en 1 kolom per monster. Het # staat voor baan 1, 2, 3 of 4 van de stroomcel. Bevindt zich in de map Alignment.
Bevat samenvattende statistieken die specifiek zijn voor de run. Bevindt zich in de map Alignment.

Analysemap
De analysemap bevat de bestanden die worden gegenereerd door de Local Run Manager-software. De relatie tussen de uitvoer- en de analysemap kan als volgt worden samengevat: u Tijdens de sequencing vult Real-Time Analysis (RTA) de uitvoermap met bestanden die tijdens de
beeldanalyse, basebepaling en kwaliteitsscore zijn gegenereerd. u RTA kopieert bestanden in realtime naar de analysemap. Nadat RTA een kwaliteitsscore heeft
toegekend aan elke basis voor elke cyclus, schrijft de software het bestand RTAComplete.txt naar beide mappen. u Wanneer het bestand RTAComplete.txt aanwezig is, begint de analyse. u Terwijl de analyse wordt voortgezet, schrijft Local Run Manager uitvoerbestanden naar de analysemap en kopieert de bestanden terug naar de uitvoermap.
Uitlijningsmappen
Telkens wanneer die analyse wordt opgevraagd, maakt de Local Run Manager een uitlijningsmap aan met de naam Alignment_N, waarbij N een volgnummer is.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

13

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Mapstructuur
Alignment: bevat .bam-, .vcf-, FASTQ-bestanden en bestanden die specifiek zijn voor de analysemodule.
Date and Time Stamp: datum- en tijdstempel van analyse als JJJJMMDD_UUMMSS AnalysisError.txt AnalysisLog.txt aggregate.report.html aggregate.report.pdf aggregate.summary.csv AmpliconCoverage_M#.tsv AmpliconRunStatistics.xml Sample1.genome.vcf.gz Sample1.coverage.csv Sample1.report.pdf Sample1.summary.csv Sample1.vcf.gz Sample1.bam FASTQ Sample1 Sample1_L001_R1_001_fastq.gz Stats DemuxSummaryF1L1.txt FastqSummaryF1L1.txt
Data Intensities BaseCalls L001: bevat .bcl-bestanden. L001: bevat .locs- bestanden. RTA Logs: bevat logboekbestanden van de RTA-softwareanalyse.
InterOp: bevat binaire bestanden die worden gebruikt om metrische gegevens van de sequencing-run te rapporteren.
Logs: bevat logboekbestanden waarin de stappen worden beschreven die zijn uitgevoerd tijdens de sequencing.
RTAComplete.txt RunInfo.xml

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

14

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx
RunParameters.xml
Basebepaling en indexdiversiteit
Wanneer monsters worden gesequencet op het NextSeq 550Dx-instrument, wordt door basebepaling een base bepaald (A, C, G of T) voor elk cluster van een bepaalde tegel of beeldvormingsgebied op de stroomcel, bij een specifieke cyclus. Het NextSeq 550Dx-instrument maakt gebruik van sequencing met twee kanalen, waardoor slechts twee beelden nodig zijn om de gegevens voor vier DNA-basen te coderen, één van het rode kanaal en één van het groene kanaal. De procedure voor basebepaling-indexbepalingen is anders dan voor basebepaling tijdens andere bepalingen. Indexbepalingen moeten beginnen met ten minste één base anders dan G in één van de eerste twee cycli. Als een indexbepaling begint met twee basebepalingen van G, wordt er geen signaalintensiteit gegenereerd. Er moet een signaal aanwezig zijn in één van de eerste twee cycli om demultiplexing-prestatie te garanderen. Bij het selecteren van indexen tijdens het maken van runs wordt een waarschuwing voor lage diversiteit weergegeven als de indexen niet aan de diversiteitseisen voldoen. U kunt deze waarschuwing voorkomen door indexsequenties te kiezen die bij elke cyclus een signaal in beide kanalen leveren. u Rood kanaal: A of C u Groen kanaal: A of T Dit basebepalingsproces garandeert nauwkeurigheid bij het analyseren van low- plexmonsters. Zie voor meer informatie over de sequenties van uw indexen de bijsluiter TruSeq Custom Amplicon Kit Dx (documentnr. 1000000029772). Tijdens het aanmaken van de run in Local Run Manager kiest u het aantal monsters dat u wilt testen. Voorgestelde indexcombinaties die voldoen aan de eisen voor indexdiversiteit worden automatisch door de software ingevuld. Hoewel u niet verplicht bent de voorgestelde indexcombinaties te gebruiken, wordt het wel aanbevolen.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

15

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Revisiegeschiedenis

Document
Documentnr. 1000000030329 v04
Documentnr. 1000000030329 v03
Doc u m e n tn r. 1000000030329 v02
Doc u m e n tn r. 1000000030329 v01
Doc u m e n tn r. 1000000030329 v00

Datum
Augustus 2021
De c e m be r 2019
Ja n u a ri 2019
Augustus 2018
November 2017

Omschrijving van wijziging Adres van de gemachtigde vertegenwoordiger van de EU bijgewerkt.
Adres van de gemachtigde vertegenwoordiger van de EU bijgewerkt. Adres van de Australische sponsor bijgewerkt. Informatie over v2.5 reagenskits toegevoegd.
Voorgeschreven markeringen bijgewerkt.
Eerste uitgave.

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

16

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Workflowhandleiding voor Germline Variant-analysemodule in Local Run Manager voor NextSeq 550Dx

Technische ondersteuning

Voor technische ondersteuning neemt u contact op met de afdeling technische ondersteuning van Illumina.

Website: E-mail:

www.illumina.com te c h su pport@ illu m in a .c om

Telefoonnummers van klantenondersteuning van Illumina

R egi o N oor d -Amer i k a Australië B el gi ë China Denemarken Duitsland Fi nl a nd Fr a nk r i j k Hongkong Ierland Italië Japan Nederland Nieuw-Zeeland Noorwegen Oos t enr i j k S i ngap or e Spanje Ta i wa n Verenigd Koninkrijk Z wed en Z wi t s er l and Overige landen

Gratis telefoonnummer +1 800 809 4566 +1.800.775.688 +32 80077160 400.066.5835 +45 80820183 +49 8001014940 +358 800918363 +33 805102193 800960230 +353 1800936608 +39 800985513 0800 111 5011 +31 8000222493 0800 451 650 +47 800 16836 +43 800006249 +1.800.579.2745 +34 911899417 00806651752 +44 8000126019 +46 850619671 +41 565800000 +44 1799 534 000

Regionaal telefoonnummer
+32 34002973
+45 89871156 +49 8938035677 +358 974790110 +33 170770446
+353 016950506 +39 236003759
+31 207132960
+47 21939693 +43 19286540
+34 800300143
+44 2073057197 +46 200883979 +41 800200442

Veiligheidsinformatiebladen (SDS, safety data sheets) — zijn verkrijgbaar op de website van Illumina via support.illumina.com/sds.html.
Productdocumentatie–beschikbaar voor downloaden in pdf-vorm via de website van Illumina. Ga naar support.illumina.com, selecteer een product en klik vervolgens op Documentation & Literature (Documentatie en literatuur).

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

17

BESTEMD VOOR IN-VITRODIAGNOSTIEK

Documentnr. 1000000030329 v04 NLD

Illumina 5200 Illumina Way San Diego, Californië 92122 VS +1 800 809 ILMN (4566) +1 858 202 4566 (buiten Noord-Amerika) t e c hsupport @i l l um i na . c om www.illumina.com

Illumina Netherlands B.V. Steenoven 19 5626 DK Eindhoven Nederland

Australische sponsor Illumina Australia Pty Ltd Nursing Association Building Level 3, 535 Elizabeth Street Melbourne, VIC 3000 Australië